Nuestro protocolo permite la introducción reproducible de microorganismos y agentes terapéuticos en el ojo del ratón para estudiar la patogénesis de la infección intraocular y la eficacia del tratamiento novedoso. Nuestra técnica permite establecer infecciones intraoculares en un modelo de ratón y facilita la cuantificación de microorganismos, respuestas inmunitarias del huésped, expresión génica de huésped y patógeno relacionada con la infección, y eficacia del tratamiento novedoso. La visualización del lugar de inyección, el ángulo de la aguja y la entrega son fundamentales para la ejecución exitosa de esta técnica y una cosecha ocular adecuada es esencial para la cuantificación de los parámetros de infección.
En una instalación de nivel de bioseguridad dos, agregue cinco mililitros de caldo BHI a un tubo de tapa de presión de 10 mililitros y utilice un bucle estéril para transferir una sola colonia de B.cereus de un cultivo de placa de barrena en cinco mililitros de caldo. Después de un breve vórtice, incubar la muestra en una incubadora giratoria de 37 grados Celsius a 200 revoluciones por minuto durante 18 horas. Al final de la incubación, diluir el cultivo a 200 unidades formadoras de colonias por concentración de microlitros en 10 mililitros de BHI fresco, y después de vórtices, añadir un mililitro del cultivo recién diluido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros sobre hielo.
Para la inyección intravítrea, encienda el microinyector y abra la válvula de gas en el tanque de aire comprimido conectado al microinyector. Pulse Modo en el microinyector hasta que la pantalla muestre Equilibrio. Pulse Balance y coloque el ratón del ordenador en la mesa de operaciones.
Conecte el soporte de pipeta de acero inoxidable al tubo unido a la salida de llenado en el inyector y atornille firmemente el conector del soporte de la pipeta alrededor de una aguja de punta de pipeta capilar de vidrio biselado para permitir la inserción de la aguja capilar en el otro extremo del soporte de la pipeta. Encienda el microscopio oftálmico y ajuste la intensidad de la luz en 50%Posicione el microscopio sobre el sitio del procedimiento y ajuste el microscopio al enfoque deseado. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, coloque el ratón anestesiado en su lado izquierdo en las almohadillas inferiores médicas con la nariz apuntando a la derecha.
Localice el ojo derecho a través del objetivo del microscopio oftálmico y coloque las pinzas de los fórceps de acción inversa a ambos lados del ojo para exponer el lugar de inyección. Haga clic izquierdo en el ratón conectado al microinyector para llenar la aguja capilar preparada con la solución de bacterias diluidas, y asegurar la cabeza con la mano izquierda, coloque la punta de la aguja, biselado hacia arriba, en el limbo del ojo. Con la aguja en un ángulo de 45 grados, perfore el ojo, teniendo cuidado de que sólo se inserten 0,5 milímetros de la punta afilada de la aguja.
Una vez insertada la punta de la aguja, utilice la mano izquierda para hacer clic con el botón derecho en la almohadilla del ratón para inyectar 0,5 microlitros de la solución B.cereus. Para evitar fugas, deje la punta de la aguja dentro del ojo del ratón durante dos o tres segundos antes de retirarla, luego suelte los fórceps y el ojo volverá a la cavidad por sí mismo. Transfiera el ratón a una jaula de recuperación en una almohadilla de calentamiento con monitoreo hasta la recumbencia completa.
En el punto final experimental adecuado, agregue 400 microlitros de PBS complementados con inhibidor de la proteasa en un tubo de cosecha autoclavado etiquetado por ojo en el hielo y coloque fórceps de punta fina abiertos a cada lado del ojo infectado. Empuje las puntas hacia abajo hacia la cabeza para apuntalar el ojo. Una vez que las pinzas están detrás del globo ocular, apriete las pinzas juntas y tire de los fórceps lejos de la cabeza para separar el globo ocular.
A continuación, coloque inmediatamente el globo ocular en el tubo de cosecha debidamente etiquetado. Dentro de los 60 minutos de la recolección de la muestra, coloque los tubos de recolección cerrados en un homogeneizador de tejido y homogeneice las muestras durante dos períodos de homogeneización de un minuto con un período de descanso de 30 segundos en el medio. Después de la homogeneización, coloque las muestras sobre hielo y utilice 20 microlitros alícuotas de homogeneización para diluir en serie las muestras en 180 microlitros de PBS por dilución, hasta que se alcance un factor de una vez 10 a los ocho negativos.
A continuación, etiquete cada fila de una placa BHI precale calentada cuadrada con la concentración de dilución adecuada, y con la placa inclinada en un ángulo de 45 grados, agregue 10 microlitros de cada dilución en filas individuales en la parte superior de la placa. Deje que cada muestra corra hasta que casi llegue a la parte inferior de la placa antes de colocar la placa plana. Cuando las muestras hayan sido absorbidas en el agar, transfiera la placa a una incubadora de 37 grados centígrados.
Las colonias deben comenzar a ser visibles después de ocho horas de incubación. Para una representación precisa de la concentración en la muestra, cuente la fila que tiene entre 10 y 100 colonias. La construcción de una punta de aguja de vidrio biselado es fundamental para entregar las bacterias en el medio vítreo del ojo del ratón.
En estas imágenes, Bacillus cereus crece en una placa de agar sangre y en tubos de cultivo de caldo. Como se ilustra en este gráfico de recuentos bacterianos interoculares de cinco ojos de ratón diferentes a las 10 horas post-infección entre una por 10 a la quinta y una por 10 a la séptima colonia formando unidades de bacterias normalmente se pueden recuperar de un solo ojo infectado. Lo más importante a recordar al intentar este procedimiento es inyectar ese volumen adecuado de bacterias en el ojo del ratón.
Siguiendo este procedimiento, podemos estudiar la inflamación por histología, mediadores inflamatorios por ELISA, y la expresión génica mediante la secuenciación de ARN de alto rendimiento para facilitar una mejor comprensión de la patogénesis de esta enfermedad.
