Il nostro protocollo consente l'introduzione riproducibile di microrganismi e agenti terapeutici nell'occhio del topo per studiare la patogenesi dell'infezione intraoculare e la nuova efficacia del trattamento. La nostra tecnica consente di stabilire infezioni intraoculari in un modello di topo e facilita la quantificazione dei microrganismi, le risposte immunitarie dell'ospite, l'espressione genica ospite e patogena correlata alle infezioni e la nuova efficacia del trattamento. La visualizzazione del sito di iniezione, l'angolo dell'ago e la consegna sono fondamentali per l'esecuzione riuscita di questa tecnica e un corretto raccolto oculare è essenziale per la quantificazione dei parametri di infezione.
In una struttura di livello due di biosicurezza, aggiungere cinque millilitri di brodo BHI a un tubo a scatto da 10 millilitri e utilizzare un anello sterile per trasferire una singola colonia di B.cereus da una coltura di piastre di coclea in cinque millilitri di brodo. Dopo un breve vortice, incubare il campione in un incubatore rotante di 37 gradi Celsius a 200 giri al minuto per 18 ore. Al termine dell'incubazione, diluire la coltura in una colonia di 200 unità di formazione per concentrazione di microlitri in 10 millilitri di BHI fresco e, dopo il vortice, aggiungere un millilitro della coltura appena diluita a un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri sul ghiaccio.
Per l'iniezione intravitreale, accendere il microiniettore e aprire la valvola del gas sul serbatoio dell'aria compressa collegato al microiniettore. Premere Modalità sul microiniettore fino a quando lo schermo non mostra Bilanciamento. Premere Bilanciamento e posizionare il mouse del computer sulla tabella operatoria.
Collegare il supporto della pipetta in acciaio inossidabile al tubo collegato all'uscita di riempimento sull'iniettore e avvitare saldamente il connettore del supporto della pipetta attorno a un ago della punta della pipetta capillare in vetro smussato per consentire l'inserimento dell'ago capillare nell'altra estremità del supporto della pipetta. Accendere il microscopio oftalmico e impostare l'intensità della luce sul 50%Posizionare il microscopio sul sito della procedura e regolare il microscopio sulla messa a fuoco desiderata. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale, posizionare il mouse anestetizzato sul lato sinistro sugli underpad medici con il naso puntato a destra.
Individuare l'occhio destro attraverso l'obiettivo del microscopio oftalmico e posizionare le pinng di pini ad azione inversa su entrambi i lati dell'occhio per esporre il sito di iniezione. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse collegato al microiniettore per riempire l'ago capillare preparato con la soluzione batteriche diluita e fissare la testa con la mano sinistra, posizionare la punta dell'ago, smussare il lato verso l'alto, al limbo dell'occhio. Con l'ago con un angolo di 45 gradi, forare l'occhio, facendo attenzione che vengono inseriti solo 0,5 millimetri della punta affilata dell'ago.
Una volta inserita la punta dell'ago, utilizzare la mano sinistra per fare clic con il pulsante destro del mouse sul mousepad per iniettare 0,5 microlitri della soluzione B.cereus. Per evitare perdite, lasciare la punta dell'ago all'interno dell'occhio del mouse per due o tre secondi prima della rimozione, quindi rilasciare le pinie e l'occhio tornerà nella presa da solo. Trasferire il mouse in una gabbia di recupero su una pastiglia riscaldante con monitoraggio fino alla piena rimiglia.
All'endpoint sperimentale appropriato, aggiungere 400 microlitri di PBS integrati con inibitore della proteasi in un tubo di raccolta autoclavato etichettato per occhio sul ghiaccio e posizionare forcep a punta fine aperta su entrambi i lati dell'occhio infetto. Spingere le punte verso il basso verso la testa per proptosare l'occhio. Una volta che le pinng sono dietro il globo oculare, stringi le pinng e allontana le pina dalla testa per staccare il bulbo oculare.
Quindi posizionare immediatamente il bulbo oculare nel tubo di raccolta opportunamente etichettato. Entro 60 minuti dalla raccolta del campione, posizionare i tubi di raccolta chiusi in un omogeneizzatore tissutale e omogeneizzare i campioni per due periodi di omogeneizzazione di un minuto con un periodo di riposo di 30 secondi nel mezzo. Dopo l'omogeneizzazione, posizionare i campioni sul ghiaccio e utilizzare 20 aliquote di microlitri di omogeneato per diluire serialmente i campioni in 180 microlitri di PBS per diluizione, fino a raggiungere un fattore di uno per 10 all'ottavo negativo.
Successivamente, etichettare ogni fila di una piastra BHI quadrata pre-riscaldata con l'appropriata concentrazione di diluizione e, con la piastra inclinata con un angolo di 45 gradi, aggiungere 10 microlitri di ogni diluizione in singole file nella parte superiore della piastra. Lasciare correre ogni campione fino a raggiungere quasi il fondo della piastra prima di posare la piastra piatta. Quando i campioni sono stati assorbiti nell'agar, trasferire la piastra in un incubatore di 37 gradi Celsius.
Le colonie dovrebbero iniziare ad essere visibili dopo otto ore di incubazione. Per una rappresentazione accurata della concentrazione nel campione, contare la riga che ha da 10 a 100 colonie. La costruzione di una punta dell'ago in vetro smussato è fondamentale per fornire i batteri nel mezzo vitreo dell'occhio del topo.
In queste immagini vengono mostrati Bacillus cereus che crescono su una piastra di agar del sangue e in tubi di coltura del brodo. Come illustrato in questo grafico dei conteggi batterici interoculari da cinque diversi occhi del topo a 10 ore dopo l'infezione tra uno per 10 e il quinto e uno per 10 alla settima colonia che forma unità di batteri può in genere essere recuperato da un singolo occhio infetto. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è iniettare quel volume appropriato di batteri nell'occhio del mouse.
Seguendo questa procedura, possiamo studiare l'infiammazione per istologia, i mediatori infiammatori di ELISA e l'espressione genica mediante sequenziamento dell'RNA ad alta produttività per facilitare una migliore comprensione della patogenesi di questa malattia.
