Unser Protokoll ermöglicht die reproduzierbare Einschleppung von Mikroorganismen und therapeutischen Wirkstoffen in das Mausauge, um die Pathogenese der intraokularen Infektion und die neue Behandlungswirksamkeit zu untersuchen. Unsere Technik ermöglicht die Etablierung intraokularer Infektionen in einem Mausmodell und erleichtert die Quantifizierung von Mikroorganismen, Wirtsimmunreaktionen, infektionsbedingte Wirts- und Pathogengenexpression und neuartige Behandlungswirksamkeit. Die Visualisierung der Injektionsstelle, der Nadelwinkel und die Lieferung sind entscheidend für die erfolgreiche Ausführung dieser Technik und eine richtige Augenernte ist für die Quantifizierung der Infektionsparameter unerlässlich.
In einer Anlage auf Biosicherheitsebene zwei fügen Sie fünf Milliliter BHI-Brühe zu einem 10-Milliliter-Snap-Cap-Rohr hinzu und verwenden Sie eine sterile Schleife, um eine einzelne B.cereus-Kolonie von einer Schneckenplattenkultur in fünf Milliliter Brühe zu übertragen. Nach kurzer Wirbelung die Probe in einem 37 Grad Celsius rotierenden Inkubator bei 200 Umdrehungen pro Minute für 18 Stunden inkubieren. Am Ende der Inkubation die Kultur zu einer 200 koloniebildenden Einheit pro Mikroliter Konzentration in 10 Milliliter nfrischem BHI verdünnen und nach dem Wirbeln einen Milliliter der frisch verdünnten Kultur zu einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr auf Eis geben.
Für die intravitreale Injektion den Mikroinjektor einschalten und das Gasventil am Drucklufttank öffnen, der am Mikroinjektor befestigt ist. Drücken Sie den Modus auf dem Mikroinjektor, bis auf dem Bildschirm Balance angezeigt wird. Drücken Sie Balance und legen Sie die Computermaus auf den Operationstisch.
Schließen Sie den Pipettenhalter aus Edelstahl an den Rohrhalter an, der am Füllausgang des Injektors befestigt ist, und schrauben Sie den Pipettenhalterstecker fest um eine abgeschrägte Glaskapillar-Pipettenspitzennadel, um das Einsetzen der Kapillarnadel in das andere Ende des Pipettenhalters zu ermöglichen. Schalten Sie das Ophthalmologische Mikroskop ein und stellen Sie die Lichtintensität auf 50% Position des Mikroskops über der Verfahrensstelle ein und stellen Sie das Mikroskop auf den gewünschten Fokus ein. Nachdem Sie eine fehlende Reaktion auf Pedalreflex bestätigt haben, legen Sie die anästhesierte Maus auf der linken Seite auf die medizinischen Unterpads mit der Nase nach rechts.
Suchen Sie das rechte Auge durch das ophthalmologische Mikroskopobjektiv und legen Sie die Zange von Reverse-Action-Zangen auf beiden Seiten des Auges, um die Injektionsstelle freizulegen. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf den Mikroinjektor, um die vorbereitete Kapillarnadel mit der verdünnten Bakterienlösung zu füllen und den Kopf mit der linken Hand zu sichern, legen Sie die Spitze der Nadel, Abschrägung Seite nach oben, an der Limbus des Auges. Mit der Nadel in einem 45-Grad-Winkel, punktieren Sie das Auge, wobei darauf zu achten, dass nur 0,5 Millimeter der scharfen Spitze der Nadel eingefügt wird.
Sobald die Nadelspitze eingesetzt wurde, verwenden Sie die linke Hand, um mit der rechten Maustaste auf das Mousepad zu klicken, um 0,5 Mikroliter der B.cereus-Lösung zu injizieren. Um Leckagen zu vermeiden, lassen Sie die Nadelspitze im Mausauge für zwei bis drei Sekunden vor dem Entfernen, dann lassen Sie die Zange und das Auge wird wieder in den Sockel von selbst gehen. Übertragen Sie die Maus in einen Erholungskäfig auf einem Wärmepad mit Überwachung bis zur vollen Reembency.
Am entsprechenden experimentellen Endpunkt 400 Mikroliter PBS, ergänzt mit Protease-Inhibitor, in einem markierten, autoklavierten Ernterohr pro Auge auf Eis hinzufügen und offene feine Spitzenzange auf beiden Seiten des infizierten Auges platzieren. Drücken Sie die Spitzen nach unten zum Kopf, um das Auge zu proptosisieren. Sobald die Zange hinter der Augenkugel ist, drücken Sie die Zange zusammen und ziehen Sie die Zange vom Kopf weg, um den Augapfel zu lösen.
Dann den Augapfel sofort in das entsprechend beschriftete Ernterohr legen. Innerhalb von 60 Minuten nach der Probenentnahme die geschlossenen Ernteröhrchen in einen Gewebehomogenisator geben und die Proben für zwei, eine Minute Homogenisierungsperioden mit einer 30-Sekunden-Ruhezeit dazwischen homogenisieren. Nach der Homogenisierung die Proben auf Eis legen und 20 Mikroliter Homogenat verwenden, um die Proben in 180 Mikroliter PBS pro Verdünnung seriell zu verdünnen, bis ein Faktor von einem mal 10 bis zu den negativen acht erreicht ist.
Als nächstes beschriften Sie jede Reihe einer quadratischen vorgewärmten BHI-Platte mit der entsprechenden Verdünnungskonzentration, und fügen Sie mit der in einem 45-Grad-Winkel geneigten Platte 10 Mikroliter jeder Verdünnung in einzelne Reihen an der Oberseite der Platte hinzu. Lassen Sie jede Probe laufen, bis sie fast den Boden der Platte erreicht, bevor Sie die Platte flach legen. Wenn die Proben in den Agar aufgenommen wurden, übertragen Sie die Platte auf einen 37 Grad Celsius Inkubator.
Kolonien sollten nach acht Stunden Inkubation sichtbar werden. Um eine genaue Darstellung der Konzentration in der Stichprobe zu finden, zählen Sie die Zeile, die zwischen 10 und 100 Kolonien aufweist. Die Konstruktion einer abgeschrägten Glasnadelspitze ist entscheidend für die Rückführung der Bakterien in die Mitte des Mausauges.
In diesen Bildern werden Bacillus cereus gezeigt, der auf einer Blutagarplatte und in Brühekulturröhren wächst. Wie in dieser Grafik der interokularen Bakterienzahlen von fünf verschiedenen Mausaugen bei 10 Stunden nach der Infektion zwischen einem Mal 10 bis fünf und ein mal 10 bis zur siebten Kolonie bildende Einheiten von Bakterien gezeigt, können in der Regel von einem einzigen infizierten Auge zurückgewonnen werden. Das Wichtigste, was sie beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollten, ist, das entsprechende Volumen von Bakterien in das Mausauge zu injizieren.
Nach diesem Verfahren können wir Entzündungen mittels Histologie, Entzündungsmediatoren durch ELISA und Genexpression durch RNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz untersuchen, um ein besseres Verständnis der Pathogenese dieser Krankheit zu ermöglichen.
