우리의 프로토콜은 자궁 내 감염및 새로운 처리 효과의 병발생을 연구하기 위하여 마우스 눈에 미생물 및 치료에이전트의 재현가능한 소개를 허용합니다. 우리의 기술은 마우스 모형에 안구 감염을 설치할 수 있고 미생물의 양, 호스트 면역 반응, 감염 관련 숙주 및 병원체 유전자 발현 및 새로운 처리 효력을 용이하게 합니다. 주사 부위의 시각화, 바늘 각도 및 전달은 이 기술의 성공적인 실행에 매우 중요하며 적절한 눈 수확은 감염 매개 변수의 정량화에 필수적입니다.
생물 안전 수준 2 시설에서 는 10 밀리리터 스냅 캡 튜브에 BHI 국물의 5 밀리리터를 추가하고 멸균 루프를 사용하여 오거 플레이트 배양에서 5 밀리리터의 국물에 B.cereus 식민지 를 전송합니다. 짧은 소용돌이 후, 18 시간 동안 분당 200 회전에서 섭씨 37도 회전 인큐베이터에서 샘플을 배양. 인큐베이션의 끝에서, 신선한 BHI의 10 밀리리터에서 마이크로 리터 농도 당 200 식민지 형성 단위로 배양을 희석하고, 소용돌이 후, 얼음에 1.5 밀리리터 미세 센심분리기 튜브에 갓 희석 배양의 1 밀리리터를 추가합니다.
인트라비탈 주사의 경우 마이크로인젝터를 켜고 마이크로인젝터에 부착된 압축 공기 탱크의 가스 밸브를 엽니다. 화면이 밸런스가 표시될 때까지 마이크로인젝터에서 모드를 누릅니다. 균형을 누르고 컴퓨터 마우스를 작동 테이블에 놓습니다.
스테인레스 스틸 파이펫 홀더를 인젝터의 채우기 출력에 부착된 튜브에 연결하고 코브레드 유리 모세관 파이펫 팁 바늘 주위의 파이펫 홀더 커넥터를 단단히 나사로 고정하여 피펫 홀더의 다른 쪽 끝에 모세관 바늘을 삽입할 수 있습니다. 안과 현미경을 켜고 발광 강도를 50%로 설정하여 현미경을 절차 부위에 배치하고 현미경을 원하는 초점으로 조정합니다. 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 코를 오른쪽으로 가리키는 의료 언더 패드에 마취 마우스를 왼쪽에 놓습니다.
안과 현미경 목표를 통해 오른쪽 눈을 찾아 주사 부위를 노출하기 위해 눈의 양쪽에 역작용 집게의 집게를 배치한다. 왼쪽은 마이크로인젝터에 연결된 마우스를 클릭하여 제조된 모세관 바늘을 희석된 박테리아 용액으로 채우고, 왼손으로 머리를 고정하고, 바늘의 끝을, 비스벨 쪽을 눈의 변두리에서 놓습니다. 바늘을 45도 각도로, 바늘의 날카로운 끝의 0.5 밀리미터만 삽입되는 것을 주의하여 눈을 뚫습니다.
바늘 팁이 삽입되면 마우스 패드를 마우스 패드에 마우스 패드를 마우스 패드를 마우스 패드에 마우스 패드를 마우스 패드에 마우스 패드를 클릭하여 B.cereus 용액의 0.5 마이크로 리터를 주입하십시오. 누출을 방지하기 위해 제거하기 전에 2~3초 동안 마우스 눈 안쪽에 바늘 끝을 두고 포셉을 풀어 주면 눈이 소켓으로 다시 들어갑니다. 마우스를 전체 재조정이 있을 때까지 모니터링하여 온난화 패드의 복구 케이지로 옮길 수 있습니다.
적절한 실험 적 끝점에서, 얼음에 눈 당 표시 된, 자동 화 수확 튜브에 프로테아제 억제제로 보충 PBS의 400 마이크로 리터를 추가하고 감염된 눈의 양쪽에 열린 미세 팁 집게를 배치합니다. 팁을 머리 쪽으로 아래로 밀어 눈을 전파합니다. 집게가 눈 의 세계 뒤에 있으면 집게를 함께 짜내고 머리에서 집게를 당겨 안구를 분리하십시오.
그런 다음 즉시 적절하게 표시된 수확 튜브에 안구를 놓습니다. 샘플 수집 60분 이내에 폐쇄된 수확 튜브를 조직 균질화기에 넣고 30초의 휴식 기간을 가진 2분, 1분 의 균질화 기간 동안 샘플을 균질화합니다. 균질화 후, 얼음에 샘플을 놓고 20 마이크로리터 알리쿼트의 균질화를 사용하여 희석당 PBS의 180 마이크로리터에서 시료를 일련 적으로 희석하여 1배 10~음수 8에 도달한다.
다음으로, 적절한 희석 농도로 정사각형 미리 따뜻해지는 BHI 플레이트의 각 행에 라벨을 붙이고, 플레이트가 45도 각도로 기울어져 있는 경우, 각 희석제 10마이크로리터를 플레이트 상단의 개별 행에 추가합니다. 접시를 평평하게 놓기 전에 각 샘플이 접시 바닥에 거의 도달할 때까지 실행합니다. 샘플이 한천에 흡수되면 플레이트를 섭씨 37도인큐베이터로 옮기습니다.
식민지는 배양 8 시간 후에 보이기 시작해야 합니다. 샘플의 농도를 정확하게 표현하려면 10~100개의 콜로니가 있는 행을 계산합니다. beveled 유리 바늘 팁의 건설은 마우스 눈의 중간 유리체로 박테리아를 전달하는 데 중요합니다.
이 심상에서, 혈액 한천 접시와 국물 배양 튜브에서 성장하는 바실러스 세레우스가 표시됩니다. 이 그래프에 도시된 바와 같이 10시간 후 감염 시 5개의 상이한 마우스 눈에서 10시간 사이 10시간, 제7식민지 형성 단위에서 세균의 형성 단위는 전형적으로 단일 감염된 눈으로부터 회복될 수 있다. 이 절차를 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 마우스 눈에 박테리아의 적절한 양을 주입하는 것입니다.
이 절차에 따라, 우리는 조직학에 의해 염증을 연구 할 수 있습니다, ELISA에 의한 염증 중재자, 높은 처리량 RNA 시퀀싱에 의해 유전자 발현이 질병의 발병의 더 나은 이해를 용이하게.
