Наш протокол позволяет воспроизводимое введение микроорганизмов и терапевтических средств в глаз мыши для изучения патогенеза внутриглазной инфекции и новой эффективности лечения. Наша методика позволяет внутриглазных инфекций, которые будут созданы в модели мыши и облегчает количественной оценки микроорганизмов, принимающей иммунной реакции, инфекции, связанные с принимающей и патогенной экспрессии генов, и новая эффективность лечения. Визуализация места инъекции, угол иглы и доставка имеют решающее значение для успешного выполнения этого метода и надлежащего сбора глаз имеет важное значение для количественной оценки параметров инфекции.
В биобезопасности уровне два объекта, добавить пять миллилитров бульона BHI в 10 миллилитров оснастки крышка трубки и использовать стерильную петлю для передачи одной колонии B.cereus из культуры ожитель пластины в пять миллилитров бульона. После краткого вихря, инкубировать образец в 37 градусов по Цельсию вращающегося инкубатора на 200 оборотов в минуту в течение 18 часов. В конце инкубации разбавьте культуру до 200 единиц на микролитр концентрации в 10 миллилитров свежего BHI, а после вихря добавьте один миллилитр свежеотбавленной культуры в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку на льду.
Для внутривитреального впрыска включите микроинъектор и откройте газовый клапан на сжатом воздушном баке, прикрепленном к микроинъектору. Режим нажмите на микроинъектор до тех пор, пока на экране не будет показан баланс. Нажмите баланс и поместите компьютерную мышь на операционный стол.
Подключите держатель пипетки из нержавеющей стали к трубе, прикрепленной к выходу заполнения на инжекторе, и плотно привинчивите разъем держателя пипетки вокруг скошенной стеклянной капиллярной иглы, чтобы позволить вставить капиллярную иглу в другой конец держателя пипетки. Включите офтальмологический микроскоп и установите интенсивность света до 50%Позиция микроскопа над местом процедуры и настроить микроскоп к желаемому фокусу. После подтверждения отсутствия реакции на педаль рефлекс, поместите анестезировал мышь на левой стороне на медицинские underpads с носом указал на право.
Найдите правый глаз через офтальмологический микроскоп цели и место щипцы обратного действия щипцы по обе стороны от глаза, чтобы разоблачить место инъекции. Слева щелкните мышь, подключенную к микроинъектору, чтобы заполнить подготовленную капиллярную иглу раствором разбавленных бактерий, и закрепив голову левой рукой, поместите кончик иглы, скошенную сторону вверх, на лимбус глаза. С помощью иглы под углом 45 градусов проткнули глаз, заботясь о том, чтобы только 0,5 миллиметра острого кончика иглы вставлялись.
После того, как кончик иглы был вставлен, используйте левую руку вправо нажмите на коврик для мыши, чтобы ввести 0,5 микролитров раствора B.cereus. Чтобы предотвратить утечку, оставьте кончик иглы внутри мыши глаза в течение двух-трех секунд, прежде чем удалить, а затем отпустите типсы и глаз вернется в гнездо сам по себе. Перенесите мышь в клетку восстановления на нагревание площадку с мониторингом до полного лежачих.
В соответствующей экспериментальной конечной точке добавьте 400 микролитров PBS, дополненных ингибитором протеазы в одной помеченной, автоклавной трубке сбора урожая на глаз на льду и поместите открытые тонкие миппы кончика по обе стороны от инфицированного глаза. Нажмите кончики вниз к голове, чтобы опора глаза. После того, как щипцы находятся за шаром глаз, сожмите щипцы вместе и вытащить щипцы от головы, чтобы отделить глазное яблоко.
Затем немедленно поместите глазное яблоко в соответствующую помеченную трубку для сбора урожая. В течение 60 минут после сбора образцов поместите закрытые трубки для сбора урожая в одногенизатор тканей и гомогенизируйте образцы в течение двух, одной минуты периодов гомогенизации с 30-секундным периодом отдыха между ними. После гомогенизации поместите образцы на лед и используйте 20 микролитров алицитов гомогената, чтобы последовательно разбавить образцы в 180 микролитров PBS на разбавление, пока не будет достигнут один раз от 10 до отрицательной восьмерки.
Далее, этикетка каждого ряда квадратной предварительно разогретой пластины BHI с соответствующей концентрацией разбавления, и с пластиной наклонена под углом 45 градусов, добавить 10 микролитров каждого разбавления в отдельные ряды в верхней части пластины. Пусть каждый образец работает, пока он почти не достигнет нижней части пластины перед укладкой пластины плоской. Когда образцы были поглощены в агар, перенесите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию.
Колонии должны начать быть видны после восьми часов инкубации. Для точного представления концентрации в выборке подсчитайте строку, которая имеет от 10 до 100 колоний. Конструкция скошенной стеклянной иглы наконечник имеет решающее значение для доставки бактерий в середине стекловидного глаза мыши.
На этих снимках показаны бациллы cereus, растущие на пластине агара крови и в трубках культуры бульона. Как показано на этом графике внутриглазных бактериальных рассчитывает из пяти различных глаз мыши на 10 часов после заражения от одного раза 10 до пятого и один раз от 10 до седьмой колонии формирования единиц бактерий, как правило, могут быть извлечены из одного инфицированного глаза. Самое главное помнить при попытке этой процедуры заключается в том, чтобы придать, что соответствующий объем бактерий в мышиный глаз.
После этой процедуры, мы можем изучить воспаление по гистологии, воспалительные посредники ELISA, и экспрессия генов с высокой пропускной способностью РНК секвенирования, чтобы облегчить лучшее понимание патогенеза этого заболевания.
