Nosso protocolo permite a introdução reprodutível de microrganismos e agentes terapêuticos no olho do rato para estudar a patogênese da infecção intraocular e a eficácia do novo tratamento. Nossa técnica permite que infecções intraoculares sejam estabelecidas em um modelo de camundongos e facilita a quantitação de microrganismos, respostas imunes hospedeiras, expressão genética de hospedeiro e patógeno relacionada à infecção, e nova eficácia do tratamento. A visualização do local da injeção, ângulo da agulha e entrega são fundamentais para a execução bem sucedida desta técnica e uma colheita adequada dos olhos é essencial para a quantificação dos parâmetros de infecção.
Em uma instalação de nível dois de biossegurança, adicione cinco mililitros de caldo BHI a um tubo de tampa de snap de 10 mililitros e use um laço estéril para transferir uma única colônia B.cereus de uma cultura de placa auger em cinco mililitros de caldo. Após um breve vórtice, incubar a amostra em uma incubadora rotativa de 37 graus Celsius a 200 revoluções por minuto durante 18 horas. No final da incubação, dilui a cultura a uma colônia de 200 unidades formando unidades por concentração de microlitres em 10 mililitros de BHI fresco, e após o vórtice, adicione um mililitro da cultura recém-diluída a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro no gelo.
Para injeção intravireal, ligue o microinjetor e abra a válvula de gás no tanque de ar comprimido ligado ao microinjetor. Pressione o modo no microinjetor até que a tela mostre Balance. Pressione balance e coloque o mouse do computador na mesa de operação.
Conecte o suporte de pipeta de aço inoxidável ao tubo ligado à saída de enchimento no injetor e enrosque firmemente o conector do suporte da pipeta em torno de uma agulha de ponta de pipeta capilar de vidro chanfrada para permitir a inserção da agulha capilar na outra extremidade do suporte da pipeta. Ligue o microscópio oftálmico e ajuste a intensidade da luz para 50% Posicione o microscópio sobre o local do procedimento e ajuste o microscópio para o foco desejado. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, coloque o rato anestesiado no lado esquerdo nos subpads médicos com o nariz apontado para a direita.
Localize o olho direito através do objetivo do microscópio oftálmico e coloque as pinças de fórceps de ação reversa em ambos os lados do olho para expor o local da injeção. Clique à esquerda do mouse conectado ao microinjetor para encher a agulha capilar preparada com a solução de bactérias diluídas, e fixar a cabeça com a mão esquerda, coloque a ponta da agulha, lado de bisel para cima, no limbus do olho. Com a agulha em um ângulo de 45 graus, fure o olho, tomando cuidado para que apenas 0,5 milímetros da ponta afiada da agulha seja inserido.
Uma vez que a ponta da agulha tenha sido inserida, use a mão esquerda para o clique direito no mousepad para injetar 0,5 microliters da solução B.cereus. Para evitar vazamentos, deixe a ponta da agulha dentro do olho do rato por dois a três segundos antes de remover, em seguida, solte os fórceps e o olho voltará para a tomada sozinho. Transfira o mouse para uma gaiola de recuperação em uma almofada de aquecimento com monitoramento até a recumbência total.
No ponto final experimental apropriado, adicione 400 microliters de PBS complementados com inibidor de protease em um tubo de colheita autoclavado e autoclavado por olho no gelo e coloque fórceps de ponta fina abertos em ambos os lados do olho infectado. Empurre as pontas para baixo em direção à cabeça para sustentar o olho. Uma vez que as pinças estão atrás do globo ocular, aperte as pinças juntas e puxe os fórceps para longe da cabeça para desprender o globo ocular.
Em seguida, coloque imediatamente o globo ocular no tubo de colheita apropriadamente rotulado. Dentro de 60 minutos após a coleta da amostra, coloque os tubos de colheita fechados em um homogeneizador de tecido e homogeneize as amostras por dois períodos de homogeneização de um minuto com um período de descanso de 30 segundos no meio. Após a homogeneização, coloque as amostras no gelo e utilize 20 alíquotas de microliter de homogeneização para diluir serialmente as amostras em 180 microliters de PBS por diluição, até que um fator de uma vez 10 para os oito negativos seja atingido.
Em seguida, rotule cada linha de uma placa BHI pré-aquecida quadrada com a concentração de diluição apropriada, e com a placa inclinada em um ângulo de 45 graus, adicione 10 microliters de cada diluição em linhas individuais na parte superior da placa. Deixe cada amostra funcionar até que ela quase atinja o fundo da placa antes de colocar a placa plana. Quando as amostras tiverem sido absorvidas no ágar, transfira a placa para uma incubadora de 37 graus Celsius.
As colônias devem começar a ser visíveis após oito horas de incubação. Para uma representação precisa da concentração na amostra, conte a linha que tem entre 10 a 100 colônias. A construção de uma ponta de agulha de vidro chanfrada é fundamental para entregar a bactéria no meio do vitreous do olho do rato.
Nessas imagens, bacilo cereus crescendo em uma placa de ágar de sangue e em tubos de cultura de caldo são mostrados. Como ilustrado neste gráfico de bactérias interoculares, as contagens de bactérias de cinco diferentes olhos de camundongos a 10 horas após a infecção entre uma vez e 10 vezes 10 para a sétima colônia formando unidades de bactérias podem normalmente ser recuperadas de um único olho infectado. A coisa mais importante a se lembrar ao tentar este procedimento é injetar esse volume apropriado de bactérias no olho do rato.
Após este procedimento, podemos estudar inflamação por histologia, mediadores inflamatórios pela ELISA e expressão genética por sequenciamento de RNA de alto rendimento para facilitar uma melhor compreensão da patogênese desta doença.
