当社のプロトコルは、眼内感染の病因と新しい治療効果を研究するために、マウスの目に微生物および治療薬を再現可能に導入することを可能にします。我々の技術は、マウスモデルで眼内感染を確立することを可能にし、微生物の定量、宿主免疫応答、感染関連宿主および病原体遺伝子発現、および新しい治療効果を促進する。注射部位、針角、および送達の可視化は、この技術の実行を成功させるために重要であり、適切な眼の収穫は、感染パラメータの定量化に不可欠である。
バイオセーフティレベル2の施設では、10ミリリットルのスナップキャップチューブに5ミリリットルのBHIスープを加え、滅菌ループを使用してオーガープレート培養物から5ミリリットルのスープに単一のB.セレウスコロニーを移管します。短い渦の後、18時間毎分200回転で37°C回転インキュベーターでサンプルをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、新鮮なBHIの10ミリリットルでマイクロリットル濃度あたり200コロニー形成単位に培養を希釈し、ボルテックス後、氷上の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに希釈したばかりの培養物を1ミリリットル加えます。
ビトリアルインジェクションの場合は、マイクロインジェクターをオンにして、マイクロインジェクタに取り付けられた圧縮空気タンクのガスバルブを開きます。マイクロインジェクタのモードを押して、画面にバランスが表示されるまで押します。バランスを押して、コンピュータを操作テーブルの上に置きます。
ステンレス鋼のピペットホルダーをインジェクタの充填出力に取り付けたチューブに接続し、ベベリングガラスキャピラリーピペットチップ針の周りにピペットホルダーコネクタをしっかりとねじ込み、ピペットホルダーのもう一方の端にキャピラリー針を挿入できるようにします。眼科顕微鏡をオンにし、光強度を処置部位の上に50%位置に設定し、顕微鏡を所望の焦点に合わせます。ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、麻酔マウスを右側を指し示した医療アンダーパッドの左側に置きます。
眼科顕微鏡の目的を通して右目を見つけ、逆作用鉗子のトングを眼の両側に置いて注射部位を露出させる。マイクロインジェクターに接続されたマウスを左クリックして、調製した毛細血管の針を希釈された細菌溶液で満たし、頭を左手で固定し、針の先端を置き、ベベル側を上に、目の四肢に置きます。針を45度の角度で、目を穿刺し、針の鋭い先端の0.5ミリメートルのみが挿入されるのに注意してください。
針先を挿入したら、左手でマウスパッドを右クリックして0.5マイクロリットルのB.cereus溶液を注入します。漏れを防ぐために、マウスの目の中に針の先端を2〜3秒間放置してから取り外し、鉗子を離すと目自体がソケットに戻ります。完全な回復まで監視と温暖化パッド上の回復ケージにマウスを転送します。
適切な実験エンドポイントで、プロテアーゼ阻害剤を添加した400マイクロリットルのPBSを氷上の1つの目あたりオートクレーブ収穫チューブに加え、感染した眼の両側に開いた微細な先端鉗子を置きます。先端を頭に向かって押し下げて目を突き止める。トングが目の地球儀の後ろになったら、トングを一緒に絞り、鉗子を頭から引き離して眼球を取り外します。
その後、すぐに適切にラベル付け収穫管に眼球を置きます。サンプル採取から60分以内に、閉じた収穫チューブを組織ホモジナイザーに入れ、サンプルを2分間均質化し、その間に30秒の休息期間を有する1分間の均質化期間を有する。均質化後、サンプルを氷の上に置き、ホモゲネートの20マイクロリットルアリコートを使用して、希釈あたり180マイクロリットルのPBSでサンプルを連続的に希釈し、マイナス8に10倍の因子に達するまで使用する。
次に、適切な希釈濃度で正方形の事前温められたBHIプレートの各行にラベルを付け、プレートを45度の角度で傾けて、各希釈液の10マイクロリットルをプレートの上部の個々の行に追加します。プレートを平らにする前に、各サンプルがプレートの底にほぼ達するまで実行します。試料が寒天に吸収されたら、プレートを摂氏37度のインキュベーターに移します。
コロニーは、8時間のインキュベーションの後に見えるように始めるはずです。サンプル中の濃度を正確に表すために、10~100コロニーの間の行を数えます。ベベリングガラス針先端の構築は、マウスの目の中硝子体に細菌を送達するために重要です。
これらの画像では、血液寒天板およびスープ培養管に成長するセレウス菌が示されている。このグラフに示すように、感染後10時間で5つの異なるマウスの目から5つの異なるマウスの目から数え、細菌の1回10〜5番目のコロニー形成ユニットの間の1回と第7コロニー形成単位の1回の間で、典型的には単一の感染した眼から回収することができる。この手順を試みる際に覚えておくべきことは、マウスの目にその適切な量の細菌を注入することです。
この手順に従って、ELISAによる病態、ELISAによる炎症メディエーター、および高スループットRNAシーケンシングによる遺伝子発現による炎症を研究し、この疾患の病因をよりよく理解することができます。
