El análisis de lipoproteínas plasmáticas es muy importante para el diagnóstico de hiperlipidemia y la investigación de la aterosclerosis. En este protocolo, introduciremos el método básico usando ultracentrifugación para aislar lipoproteínas plasmáticas. Este método permite a los investigadores utilizar un mililitro de plasma para aislar siete fracciones de lipoproteína.
Estas fracciones se pueden utilizar para el de lípidos, apolipoproteínas, así como estudios bien funcionales Este método se puede aplicar tanto para muestras humanas como animales para el diagnóstico de dislipidemia y la enfermedad relacionada. Comience transfiriendo un mililitro de plasma a cada tubo ultracentrífuga de policarbonato. A continuación, cargue los tubos en un rotor de ángulo fijo y centrífuga el plasma a 356.000 veces G durante 2,5 horas a cuatro grados centígrados.
Ajuste la posición de la hoja en la cortadora del tubo a un nivel entre la fracción superior y la fracción inferior. Corta los tubos usando una cortadora y recoge la fracción superior, aproximadamente 200 microlitros, en un nuevo micro tubo. Recoge la fracción inferior restante en un nuevo tubo ultracentrífuga de policarbonato para la siguiente separación.
Ajuste el volumen total a 800 microlitros añadiendo la misma solución de densidad. Ajuste la fracción inferior a una densidad de 1,02 gramos por mililitro añadiendo 58,9 microlitros de solución de 1,21 gramos por mililitro, y 141,1 microlitros de 1,02 gramos por solución de mililitro para un volumen total de un mililitro. Cargue estos tubos en el rotor de ángulo fijo y centrífuga a 356.000 veces G durante 2,5 horas a cuatro grados centígrados.
Continúe recogiendo fracciones superiores, ajustando la densidad de las fracciones inferiores, y centrifugando para densidades de fracción de 1.02, 1.04, 1.06, 1.08, 1.1 y 1.21 gramos por mililitro. Para la ultracentrifugación final, centrífuga a 513.000 veces G durante cuatro horas a cuatro grados Centígrados. Perfiles de lipoproteína de conejos alimentados ya sea una dieta estándar normal o una dieta alta en colesterol se muestran aquí.
Los conejos son herbívoros, por lo que sus niveles plasmáticos de TC, TG y PL son generalmente más bajos que los de humanos y ratones. En los conejos estándar normales alimentados por dieta, tc se distribuye principalmente en HDL3 y LDL. En conejos de tipo salvaje en una dieta estándar normal, el 39% de los TG plasmáticos se distribuyen en VLDLs, mientras que el 57% de la PL plasmática está contenida en HDL3.
Cuando los conejos fueron desafiados con una dieta alta en colesterol, desarrollaron rápidamente hipercolesterolemia. Sus perfiles de lipoproteína se caracterizaron por una marcada elevación de VLDLs. Siete fracciones de lipoproteína de conejos de tipo salvaje alimentados con un estándar normal o una dieta alta en colesterol se ejecutaron en un gel de poliacrilamida SDS y se visualizaron con tinción de CBB.
En una dieta alta en colesterol, tanto el contenido de ApoB-100 como el contenido de ApoE en VLDLs, IDL y PMA fueron marcadamente elevados. La hinchazón occidental se utilizó para comparar los perfiles de apolipoproteínas y lipoproteínas de tres conejos hiperlipidémicos diferentes: conejos salvajes alimentados con dieta alta en colesterol, conejos knockout ApoE y conejos hiperlipidémicos hereditarias de Watanabe con deficiencia de receptores LDL. El ApoB que contiene partículas de conejos salvajes alimentados con dieta alta en colesterol se caracteriza por un aumento del contenido de ApoB-100 y ApoE, mientras que los conejos knockout ApoE mostraron un aumento de ApoB-48 junto con la apariencia de ApoA-1.
Los conejos hiperlipidémicos hereditarios de Watanabe son genéticamente deficientes en las funciones de los receptores LDL, por lo que se observó un marcado aumento de ApoB-100 en los LDL acompañados de una reducción de la ApoA-1 en los HDL, similar a los pacientes con hipercolesterolemia familiar humana. La recuperación de muestras es la más crítica en este procedimiento. Para minimizar la pérdida de la muestra, uno debe tener cuidado de recoger fracción y disolver completamente la precipitación viscosa en la fracción inferior.
Después de la recolección de siete fracciones de lipoproteína, la diálisis es necesario para la clasificación. Una vez completada la diálisis, las lipoproteínas muestras para su análisis utilizando la página SDS, la hinchazón occidental y el estudio basado en células. En el entorno clínico, ultracentrifugación generalmente separa lipoproteínas en cuatro fracciones.
El método actual puede aislar siete fracciones de lipoproteínas, que proporciona más detalles de lipoproteínas para la investigación de la hiperlipidemia.
