혈장 지단백질의 분석은 고지혈증의 진단 및 동맥 경화증의 조사를 위해 아주 중요합니다. 이 프로토콜은 극성 심분리를 사용하여 플라즈마 지단백질을 분리하는 기본 방법을 소개합니다. 이 방법을 통해 연구자들은 플라즈마 1밀리리터를 사용하여 7개의 지단백질 분획을 분리할 수 있습니다.
이러한 분획은 지질, 아폴리포단백질뿐만 아니라 기능성 연구에 사용될 수 있으며, 이 방법은 이지질혈증 및 관련 질환의 진단을 위해 인간 및 동물 샘플 모두에 적용될 수 있다. 각 폴리카보네이트 초원심분리기 튜브에 플라즈마 1밀리리터를 전송하여 시작합니다. 그런 다음 튜브를 고정 각도 로터에 넣고 플라즈마를 섭씨 356, 000배 G에서 섭씨 4도에서 2.5시간 동안 로드합니다.
튜브 슬라이서의 블레이드 위치를 상단 분획과 아래쪽 분수 사이의 수준으로 조정합니다. 슬라이서를 사용하여 튜브를 자르고 상위 분획인 약 200 마이크로리터를 새로운 마이크로 튜브로 수집합니다. 다음 분리를 위해 나머지 바닥 분획을 새로운 폴리카보네이트 초원심분리기 튜브로 수집합니다.
동일한 밀도 솔루션을 추가하여 총 볼륨을 800 마이크로리터로 조정합니다. 밀리리터 용액당 58.9 마이크로리터 1.21그램, 밀리리터 용액 당 1.02그램의 141.1 마이크로리터를 1밀리리터의 총 부피에 1.02그램의 마이크로리터를 추가하여 밀리리터당 1.02그램의 밀도로 바닥 분수를 조정합니다. 고정 각도 로터와 원심분리기에서 이 튜브를 섭씨 4도에서 2.5시간 동안 000배 G로 로드합니다.
밀리리터당 1.02, 1.04, 1.06, 1.08, 1.1 및 1.21그램의 분수 밀도에 대해 상단 분획을 계속 수집하고, 바닥 분수의 밀도를 조정하고, 원심분리를 합니다. 최종 초원심분리기의 경우, 원심분리기는 섭씨 4도에서 4시간 동안 513회, 000배 G입니다. 일반적인 표준 규정식 또는 높은 콜레스테롤 규정식을 공급하는 토끼의 지단백질 단면도는 여기에서 표시됩니다.
토끼는 초식 동물, 그래서 그들의 혈장 TC, TG, 그리고 PL 수준은 일반적으로 인간과 마우스의 그 보다는 더 낮습니다. 정상적인 표준 다이어트 먹이 토끼에서, TC는 주로 HDL3 및 LDL에 분포. 일반적인 표준 식단에 야생 형 토끼에서, 플라즈마 TG의 39 %는 VLDLs에 분포, 플라즈마 PL의 57 %는 HDL3에 포함되어 있습니다.
토끼는 높은 콜레스테롤 다이어트와 도전 했을 때, 그들은 신속 하 게 콜레스테롤 혈 증을 개발. 그들의 지단백질 단면도는 VLDLs의 표시된 고도에 의해 특징지어졌습니다. 야생 형 토끼에서 7 개의 지단백질 분획은 일반적인 표준 또는 고콜레스테롤 규정식을 공급하는 SDS polyacrylamide 젤에 실행되고 CBB 염색으로 시각화되었습니다.
고콜레스테롤 식단에서, VLDL, IdL 및 LdL에 있는 ApoB-100 및 ApoE 내용 둘 다 현저하게 상승했습니다. 서양 블로팅은 세 가지 다른 고지질 토끼의 아포포단백질과 지단백질 프로파일을 비교하는 데 사용되었다: 높은 콜레스테롤 다이어트 먹이 야생 형 토끼, ApoE 녹아웃 토끼, LDL 수용체 결핍과 와타나베 헤립성 고지질 토끼. 고콜레스테롤 식이요법 야생형 토끼의 입자를 함유한 ApoB는 ApoB-100 및 ApoE 함량증가를 특징으로 하는 반면, 아포에 녹아웃 토끼는 ApoA-1의 출현과 함께 ApoB-48의 증가를 보였다.
와타나베 유전성 고지립성 토끼는 LDL 수용체 기능에서 유전적으로 결핍되어, 그래서 LDL에서 감소된 ApoA-1을 동반하여 LdL에서 ApoB-100의 현저한 증가를 관찰하였음, 인간 가족 성 고콜레스테롤혈증 환자와 유사하게 관찰되었다. 샘플 복구는 이 절차에서 가장 중요합니다. 시료 손실을 최소화하기 위해 분획을 수집하고 점성 강수량을 바닥 분획에서 완전히 용해하도록 주의해야 합니다.
7개의 지단백질 분획의 집합 후에, 투석은 분류를 위해 요구됩니다. 투석이 완료되면, 지단백질은 SDS 페이지, 서부 블로팅 및 세포 기반 연구를 사용하여 분석을 위해 샘플을 채취한다. 임상 환경에서, 초원심분리는 일반적으로 지단백질을 4개의 분수로 분리합니다.
현재 방법은 고지혈증의 조사를 위한 지단백질의 더 많은 세부사항을 제공하는 7개의 지단백질 분수를 격리할 수 있습니다.
