血漿リポタンパク質の分析は、高脂血症の診断およびアテローム性動脈硬化症の調査にとって非常に重要です。このプロトコルでは、超遠心分離を用いて血漿リポタンパク質を単離する基本方法を紹介します。この方法により、研究者は1ミリリットルの血漿を使用して7つのリポタンパク質画分を単離することができます。
これらの画分は、脂質、アポリポタンパク質、ならびに良好な機能研究の脂質の診断にヒトおよび動物の両方のサンプルに適用することができる脂質および関連疾患の診断に適用することができる。各ポリカーボネート超遠心チューブにプラズマの1ミリリットルを転送することで開始します。その後、固定角度ローターでチューブをロードし、4°Cで2.5時間Gの356、000倍のプラズマで遠心分離機。
チューブ スライサー内のブレードの位置を、上端分数と下端分数の間のレベルに調整します。スライサーを使用してチューブをカットし、上部の分画(約200マイクロリットル)を新しいマイクロチューブに集めます。次の分離のために新しいポリカーボネート超遠心チューブに残りの底分を収集します。
同じ密度溶液を加えて、総体積を800マイクロリットルに調整します。1 ミリリットル溶液あたり 1.21 グラムの 58.9 マイクロリットルを加えて、1 ミリリットル当たり 1.02 マイクロリットルの密度に下端を調整し、1 ミリリットルの総体積に対して 1 ミリリットル溶液あたり 1.02 グラムの 141.1 マイクロリットルを加えます。これらのチューブを固定角度ローターと遠心分離機に356,000倍のGで摂氏4度で2.5時間ロードします。
下端分数の密度を調整し、1.02、1.04、1.06、1.08、1.1、1.21グラム/ミリリットルの画分密度の遠心分離を続けます。最終的な超遠心分離のために、513、000倍Gで4度摂氏で4時間遠心分離。通常の標準食または高コレステロール食のいずれかを与えられたウサギのリポタンパク質プロファイルがここに示されています。
ウサギは草食動物であるため、血漿TC、TG、PLレベルは一般的にヒトやマウスのそれよりも低い。通常の標準的な食事供給ウサギでは、TCは主にHDL3およびLDLに分布する。通常の標準食の野生型ウサギでは、血漿TGの39%がVLDLに分布し、一方、プラズマPLの57%はHDL3に含まれています。
ウサギが高コレステロール食で挑戦されたとき、彼らは急速に高コレステロール血症を発症しました。彼らのリポタンパク質プロファイルは、VLDLの顕著な上昇によって特徴付けられた。通常の標準または高コレステロール食のいずれかを与えられた野生型ウサギからの7つのリポタンパク質画分は、SDSポリアクリルアミドゲル上で実行され、CBB染色で視覚化された。
高コレステロール食では、VLDL、Idl、LDLのApoB-100およびApoE内容物の両方が著しく上昇した。ウエスタンブロッティングは、高コレステロール食供給野生型ウサギ、ApoEノックアウトウサギ、およびLDL受容体欠乏症を有する渡辺遺伝性高脂血症ウサギの3つの異なる高脂血症ウサギのアポリポタンパク質およびリポタンパク質プロファイルを比較するために使用された。高コレステロール食与野生型ウサギの粒子を含むApoBは、ApoB-100およびApoE内容物の増加を特徴とし、ApoEノックアウトウサギはApoA-1の出現と共にApoB-48の増加を示した。
渡辺ヘリテブル高脂血症ウサギは、LDL受容体機能が遺伝的に欠乏しており、ヒト家族性高コレステロール血症患者と同様に、DLのApoB-100の減少を伴うLDLのApoB-100の著しい増加が観察された。サンプルの回復は、この手順で最も重要です。サンプルの損失を最小限に抑えるために、分数を収集し、下部分数で粘性沈殿を完全に溶解するように注意する必要があります。
7つのリポタンパク質画分の収集後、透析は選別に必要である。透析が完了すると、リポタンパク質はSDSページ、ウェスタンブロッティング、および細胞ベースの研究を使用して分析するためのサンプルをサンプリングします。臨床現場では、超遠心分離は通常リポタンパク質を4つの画分に分ける。
現在の方法は、高脂血症の調査のためのリポタンパク質のより詳細を提供する7つのリポタンパク質の分画を分離することができます。
