L'analisi delle lipoproteine plasmatiche è molto importante per la diagnosi di iperlipidemia e lo studio dell'aterosclerosi. In questo protocollo, introdurremo il metodo di base usando l'ultracentrifugazione per isolare le lipoproteine plasmatiche. Questo metodo consente ai ricercatori di utilizzare un millilitro di plasma per isolare sette frazioni di lipoproteina.
Queste frazioni possono essere utilizzate per i lipidi, le apolipoproteine e studi ben funzionali Questo metodo può essere applicato sia per campioni umani che animali per la diagnosi di dislipidemia e della malattia correlata. Inizia trasferendo un millilitro di plasma in ogni tubo ultracentrifugo in policarbonato. Quindi caricare i tubi in un rotore ad angolo fisso e centrifugare il plasma a 356.000 volte G per 2,5 ore a quattro gradi Celsius.
Regolare la posizione della lama nel filtro dei tubi a un livello compreso tra la frazione superiore e la frazione inferiore. Tagliare i tubi utilizzando un filtro dei dati e raccogliere la frazione superiore, circa 200 microlitri, in un nuovo microtubo. Raccogliere la frazione inferiore rimanente in un nuovo tubo ultracentrifugo in policarbonato per la successiva separazione.
Regolare il volume totale a 800 microlitri aggiungendo la stessa soluzione di densità. Regolare la frazione inferiore a una densità di 1,02 grammi per millilitro aggiungendo 58,9 microlitri di 1,21 grammi per soluzione millilitro e 141,1 microlitri di 1,02 grammi per soluzione millilitro per un volume totale di un millilitro. Caricare questi tubi nel rotore ad angolo fisso e centrifugare a 356.000 volte G per 2,5 ore a quattro gradi Celsius.
Continuare a raccogliere le frazioni principali, regolando la densità delle frazioni inferiori e centrifugando per densità frazionarie di 1,02, 1,04, 1,06, 1,08, 1,1 e 1,21 grammi per millilitro. Per l'ultracentrifugazione finale, centrifuga a 513.000 volte G per quattro ore a quattro gradi Celsius. I profili di lipoproteina dei conigli nutriti con una normale dieta standard o una dieta ad alto colesterolo sono mostrati qui.
I conigli sono erbivori, quindi i loro livelli di plasma TC, TG e PL sono generalmente inferiori a quelli di esseri umani e topi. Nei normali conigli alimentati con dieta standard, il TC è distribuito principalmente in HDL3 e LDL. Nei conigli di tipo selvatico con una dieta standard normale, il 39% dei TG al plasma sono distribuiti in VLDL, mentre il 57% del PLASMA PL è contenuto in HDL3.
Quando i conigli sono stati sfidati con una dieta ad alto colesterolo, hanno rapidamente sviluppato ipercolesterolemia. I loro profili di lipoproteina erano caratterizzati da una marcata elevazione dei VLDL. Sette frazioni di lipoproteina da conigli di tipo selvatico alimentati con uno standard normale o una dieta ad alto colesterolo venivano eseguite su un gel di poliacrilammide SDS e visualizzate con colorazione CBB.
Con una dieta ad alto colesterolo, sia il contenuto di ApoB-100 che il contenuto di ApoE in VLDL, IDL e LDL erano marcatamente elevati. Il gonfiore occidentale è stato usato per confrontare apolipoproteine e profili lipoprotei di tre diversi conigli iperlipidemici: conigli di tipo selvatico alimentati con dieta ad alto colesterolo, conigli knockout ApoE e conigli iperlipidemici heritable Watanabe con carenza del recettore LDL. L'ApoB contenente particelle di conigli di tipo selvatico alimentati con dieta ad alto colesterolo sono caratterizzati da un aumento del contenuto di ApoB-100 e ApoE, mentre i conigli knockout ApoE hanno mostrato un aumento di ApoB-48 insieme alla comparsa di ApoA-1.
I conigli iperlipidemici heritable Watanabe sono geneticamente carenti nelle funzioni del recettore LDL, quindi è stato osservato un marcato aumento di ApoB-100 negli LDL accompagnato da un ApoA-1 ridotto negli HDL, simile ai pazienti con ipercolesterolemia familiare umana. Il ripristino del campione è il più critico in questa procedura. Per ridurre al minimo la perdita del campione, si dovrebbe fare attenzione a raccogliere la frazione e sciogliere completamente le precipitazioni viscose nella frazione inferiore.
Dopo la raccolta di sette frazioni di lipoproteina, la dialisi è necessaria per lo smistamento. Una volta completata la dialisi, le lipoproteine vengono campionali per l'analisi utilizzando la pagina SDS, il western blotting e lo studio basato sulle cellule. Nell'ambiente clinico, l'ultracentrifugazione di solito separa le lipoproteine in quattro frazioni.
Il metodo attuale può isolare sette frazioni di lipoproteine, che fornisce maggiori dettagli sulle lipoproteine per lo studio dell'iperlipidemia.
