A análise das lipoproteínas plasmáticas é muito importante para o diagnóstico de hiperlipidemia e a investigação da aterosclerose. Neste protocolo, vamos introduzir o método básico usando ultracentrifugação para isolar lipoproteínas plasmáticas. Este método permite que os pesquisadores usem um mililitro de plasma para isolar sete frações de lipoproteína.
Essas frações podem ser utilizadas para lipídios, apolipoproteínas, bem como estudos bem funcionais Este método pode ser aplicado tanto para amostras humanas quanto animais para o diagnóstico de dislipidemia e da doença relacionada. Comece transferindo um mililitro de plasma para cada tubo de ultracentrífuga de policarbonato. Em seguida, carregue os tubos em um rotor de ângulo fixo e centrifugar o plasma a 356.000 vezes G por 2,5 horas a quatro graus Celsius.
Ajuste a posição da lâmina no cortador de tubo para um nível entre a fração superior e a fração inferior. Corte os tubos usando um cortador e colete a fração superior, aproximadamente 200 microliters, em um novo micro tubo. Colete a fração inferior restante em um novo tubo de ultracentrífuga de policarbonato para a próxima separação.
Ajuste o volume total para 800 microliters adicionando a mesma solução de densidade. Ajuste a fração inferior a uma densidade de 1,02 gramas por mililitro adicionando 58,9 microliters de 1,21 gramas por solução mililitro, e 141,1 microlitres de 1,02 gramas por solução mililitro para um volume total de um mililitro. Carregue esses tubos no rotor de ângulo fixo e centrífuga a 356.000 vezes G por 2,5 horas a quatro graus Celsius.
Continue coletando frações superiores, ajustando a densidade das frações inferiores e centrifugando para densidades fracionárias de 1,02, 1,04, 1,06, 1,08, 1,1 e 1,21 gramas por mililitro. Para a ultracentrifugação final, centrífuga a 513.000 vezes G por quatro horas a quatro graus Celsius. Perfis de lipoproteína de coelhos alimentados com uma dieta padrão normal ou uma dieta de colesterol alto são mostrados aqui.
Coelhos são herbívoros, então seus níveis de TC, TG e PL de plasma são geralmente mais baixos do que os de humanos e camundongos. Em coelhos alimentados por dieta padrão normal, o TC é distribuído principalmente em HDL3 e LDL. Em coelhos do tipo selvagem em uma dieta padrão normal, 39% do TG plasmá plasma são distribuídos em VLDLs, enquanto 57% do PL de plasma está contido em HDL3.
Quando os coelhos foram desafiados com uma dieta de colesterol alto, eles rapidamente desenvolveram hipercolesterolemia. Seus perfis de lipoproteína foram caracterizados pela elevação acentuada de VLDLs. Sete frações de lipoproteína de coelhos do tipo selvagem alimentados com um padrão normal ou uma dieta de colesterol alto foram executadas em um gel de poliacrilamida SDS e visualizadas com coloração CBB.
Em uma dieta de colesterol alto, tanto os conteúdos de ApoB-100 quanto ApoE em VLDLs, IDLs e LDLs foram marcadamente elevados. A mancha ocidental foi usada para comparar apolipoproteínas e perfis de lipoproteínas de três coelhos hiperlipidêmicos diferentes: coelhos selvagens alimentados com dieta de colesterol alto, coelhos eliminatórios ApoE e coelhos hiperlipidêmicos hereditários watanabe com deficiência de receptor LDL. O ApoB contendo partículas de coelhos do tipo selvagem alimentados por dieta de colesterol alto são caracterizados pelo aumento do conteúdo de ApoB-100 e ApoE, enquanto os coelhos eliminatórios ApoE mostraram um aumento de ApoB-48 juntamente com o aparecimento de ApoA-1.
Os coelhos hiperlipidêmicos hereditários watanabe são geneticamente deficientes nas funções do receptor LDL, de modo que foi observado um aumento acentuado de ApoB-100 em LDLs acompanhados por ApoA-1 reduzido em HDLs foi observado, semelhante aos pacientes com hipercolesterolemia familiar humana. A recuperação da amostra é a mais crítica neste procedimento. Para minimizar a perda de amostra, deve-se ter cuidado para coletar fração e dissolver completamente a precipitação viscosa na fração inferior.
Após a coleta de sete frações de lipoproteína, é necessária diálise para a classificação. Uma vez que a diálise esteja completa, as lipoproteínas são amostras para análise usando a página SDS, a mancha ocidental e o estudo baseado em células. No cenário clínico, a ultracentrifugação geralmente separa as lipoproteínas em quatro frações.
O método atual pode isolar sete frações de lipoproteínas, o que fornece mais detalhes das lipoproteínas para investigação da hiperlipidemia.
