우리의 프로토콜은 행동 도중 전체 비행 두뇌의 화상 진찰을 허용합니다, 다른 두뇌 지역에 있는 뉴런이 모양을 형성하는 방법을 이해하는 것을 중요합니다. 다른 출판 프로토콜과는 달리, 이것은 비행이 냄새, 맛 또는 시각적 자극에 의해 행동하고 감지하는 동안 전체 뇌에 액세스하기 위해 특별히 개발되었다. 머리 슬롯을 만들 수 있습니다.
3D 프린터로 홀더를 인쇄한 후 스테레오 현미경 아래 평평한 표면에 직사각형으로 끈적끈적한 테이프 조각을 놓습니다. 그리고 약 5 밀리미터를 1센티미터 단위로 자른다. 테이프의 긴 측면의 중간에 400 ~ 400 마이크로 미터 다음 슬롯을 잘라, 홀더의 하단에 구멍의 아첨 측면에 테이프를 배치하기 위해 병렬로 고정 두 개의 메스를 사용합니다.
집게를 사용하여 테이프를 구멍 주위약 500 마이크로미터를 밀어 넣습니다. 그리고 테이프와 홀더의 상단을 커버검은 매니큐어를 사용합니다. 매니큐어를 적어도 한 시간 동안 건조하게 한 후 압연 조직을 사용하여 머리 슬롯에 약 1 마이크로 리터의 그리스를 추가하십시오.
바디 슬롯을 준비하려면 약 2센티미터의 와이드 테이프를 두 조각으로 자르고 1.5mm 너비의 슬라이스를 잘라냅니다. 그런 다음 0.3밀리미터 깊이의 어깨와 바디 슬롯을 잘라 테이프가 홀더에 맞는지 확인합니다. 홀더로 비행을 고정하려면 먼저 해부 현미경 아래에 얼음이있는 얕은 용기를 배치하고 홀더를 얼음 위에 놓은 실험실 조직에 거꾸로 놓습니다.
1~4일 된 암컷 과일이 사악한 곳에서 날아와 녹지 않은 얼음에 날아다닌다. 비행이 멈추면 Dell 집게를 사용하여 날개 의 기지에서 비행을 파악하고 슬롯 내부의 목을 가진 홀더로 날아갑니다. 눈은 슬롯의 양쪽에 동일하게 배치되어야 합니다.
필요한 경우 접착제가 머리 뒤쪽에 도달하지 못하도록 머리 위에 기름 을 하나 더 넣습니다. 그런 다음 몸과 얼음으로 몸을 덮어 비행이 움직이지 않도록하십시오. 머리를 고정하려면 완전히 후방 뷰에서 약 20도 각도로 배치합니다.
그리고 관심있는 감각 영역을 더럽혀지 않도록하면서 머리 주위에 UV 접착제를 적용하기 위해 압연 조직을 사용합니다. 미각 실험을 위해, 포셉을 사용하여 프로보시스를 꺼내프로보스시스 베이스에 접착제를 추가하여 움직임을 방지합니다. 미각 실험이 계획되지 않으면 프로보시스를 머리에 밀어 붙입니다.
5 초 동안 UV 빛으로 접착제를 치료하고, 조심스럽게 다리와 문 토양, 감각 영역에 충실 할 수있는 남아있는 액체 접착제를 제거하기 위해, 머리 주변 영역을 청소하기 위해 압연 조직을 사용합니다. 그런 다음 테이프 또는 조직의 얇은 스트립을 사용하여 필요에 따라 다리를 앞쪽으로 이동시하십시오. 몸을 배치하려면 얼음 용기를 제거하고 홀더를 돌립니다.
비행 주위의 물을 제거하고 마취에서 비행이 회복되기 전에 신속하게 행동하여 바디 슬롯 테이프를 구멍 위에 놓고 부드럽게 플라이의 몸을 밀어 목을 과도하게 늘리지 않도록주의하십시오. 테이프로 남아있는 큰 구멍을 덮고 머리 뒤쪽에 약 1 마이크로 리터의 그리스를 추가하여 접착제가 해당 위치에 달라붙지 않도록하십시오. 압연 조직을 사용하여 흉부 주위와 테이프와 흉부 위에 UV 접착제를 페인트하고 약 5 초 동안 UV 빛으로 접착제를 치료하십시오.
조심스럽게 실험실 조직으로 그리스와 치료되지 않은 접착제를 제거하고 머리 의 상단에 식염수 의 약 1 밀리리터를 추가합니다. 집게를 사용하여 기포를 옆으로 밀어 내고 식염수 위에 덮개 슬립을 배치하고 홀더를 돌려 앞쪽에 식염수 에 대한 확인을 하여 누출을 확인하십시오. 식염수가 관찰되면 식염수제거를 제거하고 더 많은 접착제 또는 더 많은 그리스로 구멍을 고정합니다.
머리를 해부하려면 가장 높은 배율을 선택하고 날카로운 매우 미세한 집게를 사용하여 목의 양쪽에 있는 중앙 어두운 표절 삼각형의 기저에 두 개의 컷을 만듭니다. 어두운 삼각형 주위를 잘라, 큐티클의이 부분을 제거합니다. 근육 16 과 식도는이 구멍을 통해 볼 수 있어야하 고 리드미컬하게 움직여야 합니다.
매우 미세한 집게를 사용하여 식도에 구멍을 뚫지 않고 근육 16을 끊기 위해이 영역의 상단을 조심스럽게 꼬집습니다. 리듬 운동이 근육을 중지하는 경우 16 가능성이 제거되었다. 근육이 어두운 삼각형 영역의 내측 가장자리에서 시작하여 절제된 경우, 한 쌍의 가위처럼 집게를 사용하여 작은 조각으로 나머지 표피를 조심스럽게 자르고 제거하십시오.
그런 다음 집게를 사용하여 한 번에 하나의 공기 주머니를 잡고 천천히 꾸준히 당깁니다. 이 비디오에서 칼슘 프로브는 이 두 과일 플라이 뇌의 모든 뉴런에서 발현되었습니다. 그리고 냄새의 퍼프가 제시되었다.
이 실험에서 칼슘 센서 발현은 도파민및 세로토너기세포 뉴런으로 제한되었다. 뇌를 통해 강한 동기 활동과 전체 뇌가 특정 행동 중에 관찰 할 수있는 방법을 설명하는 행동을 걷는 파리 사이의 엄격한 상관 관계를 주목하십시오. 원리 성분 분석 및 독립적인 구성 요소 분석을 사용하여 서로 다른 색상으로 강조 표시된 상이한 기능 영역을 추출할 수 있다.
기능 영역의 모양과 지역화를 통해 영역을 해부학 적 템플릿에 매핑할 수 있습니다. 뇌 영역을 식별 하 고 어떤 경우에, 신경 유형. 일단 적절한 해부학 적 템플릿 형광 값에 정렬되면 정량 적 분석을 위한 특정 해부학 적 뇌 영역 내에서 평균될 수 있다.
예를 들어, 이 분석에서는 모든 영역이 그루밍 중에보다 걷기 중에 더 활성화되어 있음을 관찰할 수 있습니다. 인내심을 가져야 합니다. 이 심장 해부 기술을 배우는 것은 어렵습니다.
내 실험실에서 사람들은 그것을 마스터하고 첫 번째 유용한 준비를하기 전에 평균 3 ~ 4 개월이 필요합니다. 이 프로토콜에 따라 우리는 형광 현미경을 사용하여 대규모 뇌 활동을 기록 할 수 있습니다. 경전현미경과 같은 빠른 방법은 특히 지적된다.
