私たちのプロトコルは、異なる脳領域のニューロンが行動を形作るためにどのように相互作用するかを理解するために重要である行動中にハエ脳全体のイメージングを可能にします。他の公表されたプロトコルとは異なり、これはハエが臭い、味や視覚的刺激によって振る舞い、感知している間、脳全体にアクセスするために特別に開発されました。ヘッドスロットを作成します。
ホルダーを3Dプリンタで印刷した後、ステレオ顕微鏡の下の平らな面に長方形で粘着テープを貼ります。そして、約5ミリメートルを1センチメートルで切ります。テープの長い側の中央にある400で400マイクロメートルの次のスロットをカットするために並行して一緒に固定された2つのメスを使用し、ホルダーの底部の穴の平らな側の上にテープを置きます。
フォースを使用して、穴の周りに約500マイクロメートルのテープを押します。そして、テープとホルダーの上部をカバーするために黒いマニキュアを使用してください。マニキュアを少なくとも1時間乾燥させた後、ロール組織を使用して、ヘッドスロットに約1マイクロリットルのグリースを加えます。
ボディスロットを準備するには、幅の広いテープを2つに2センチメートル切り、幅1.5ミリメートルのスライスをカットします。その後、0.3ミリメートルの深い肩とボディスロットを切り取り、テープがホルダーに収まることを確認します。ハエをホルダーに固定するには、まず、解剖顕微鏡の下に氷を入れた浅い容器を置き、ホルダーを氷の上に置かれた実験室組織の一部に逆さまに置きます。
生後1〜4日のメスの果物は、その卑劣なから飛び、そして、無精氷の上にハエを吹きます。フライが動かなくなったら、Dell鉗子を使って翼の基部のフライをつかみ、スロットの中に首を入れてホルダーにフライをスライドさせます。目はスロットの両側に等しく配置する必要があります。
必要に応じて、接着剤が頭の後ろに届かないように、頭の上部にグリースを1マイクロリットル加えます。その後、ハエが動かないことを確認するために、組織といくつかの氷で体を覆います。ヘッドを固定するには、完全後景から約20度の角度で配置します。
そして、巻き上げた組織を使用して、関心のある感覚領域を汚すことを避けながら、頭の周りにUV接着剤を適用します。味の実験のために、プロボシスを引き出すために鉗子を使用し、動きを防ぐためにプロボシスベースで接着剤を追加します。味の実験が計画されていない場合は、プロボシスを頭に押し込んで接着します。
5秒間UV光で接着剤を硬化させ、巻き上げた組織を使用して頭の周囲を慎重に清掃し、脚やドアの土壌、感覚領域に付着する可能性のある残りの液体接着剤を取り除きます。その後、テープやティッシュの薄いストリップを使用して、必要に応じて脚を前面に移動します。体を配置するには、氷容器を取り外し、ホルダーを回します。
ハエの周りの水を取り除き、ハエが麻酔から回復する前に素早く行動し、ボディスロットテープを穴の上に置き、首を伸ばさないで注意してハエの体を静かに押し下げます。残りの大きな穴をテープで覆い、約1マイクロリットルのグリースを頭部の後ろに加え、接着剤がその場所に貼り付けないようにします。巻き上げた組織を使用して、胸郭の周りとテープと胸郭の上にUV接着剤をペイントし、約5秒間UVライトで接着剤を治します。
実験室のティッシュでグリースおよび未硬化の接着剤を注意深く取り除き、頭部の上部に約1ミリリットルの生理食塩水を加える。鉗子を使用して気泡を押しのけ、生理気道の上にカバースリップを置き、ホルダーを回して前面の生理的な検査を行い、漏れをチェックします。生理が観察された場合は、生理し、より多くの接着剤またはより多くのグリースで穴を固定します。
頭を解剖するには、最高の倍率を選択し、首の両側の中央暗いキューティクル三角形のベースに2つのカットを行うためにシャープに非常に細かい鉗子を使用しています。暗い三角形の周りをカットし、キューティクルのこの部分を削除します。筋肉16と食道は、この穴を通して見え、リズミカルに移動する必要があります。
非常に細かい鉗子を使用して、食道を穿刺することなく、この領域の上部を慎重に切断して筋肉16を切断します。リズミカルな動きが止まった場合、筋肉16は除去された可能性が高い。暗い三角形の内側の端から始まる筋肉を切除したら、ハサミのような鉗子を使って、残りのキューティクルを小さく切り取って取り除きます。
その後、鉗子を使用して、一度に1つのエアサックをゆっくりとゆっくりと引き離します。このビデオでは、カルシウムプローブは、これら2つのフルーツフライ脳のすべてのニューロンで発現しました。そして、臭いのパフが提示されました。
今回の実験では、カルシウムセンサーの発現はドーパミン作動性およびセロトニン作動性ニューロンに限定された。脳上の強い同期活動と、特定の行動の間に脳全体を観察する方法を示すハエの歩行行動との間の緊密な相関関係に注意してください。原理成分分析と独立成分解析を使用して、異なる色で強調表示された異なる機能領域を抽出することができます。
機能領域の形状と局在により、領域を解剖的テンプレートにマッピングすることができます。脳領域を識別し、いくつかのケースで, ニューロンの種類.適切な解剖学的テンプレートに一度整列蛍光値は、定量分析のための特定の解剖学的脳領域内で平均化することができます。
たとえば、この解析では、すべての領域がグルーミング時よりも歩行中の方がアクティブであることを確認できます。辛抱強く。この心臓解剖技術を学ぶことは難しい。
私の研究室では、人々はそれを習得し、最初の有用な準備を得る前に、平均して3〜4ヶ月を必要とします。このプロトコルに従って、蛍光顕微鏡を用いて大規模な脳活動を記録することができる。光場顕微鏡のような高速方法は特に示される。
