Il nostro protocollo consente l'imaging dell'intero cervello della mosca durante il comportamento, che è importante per capire come i neuroni in diverse aree cerebrali interagiscono per modellare il comportamento. A differenza di altri protocolli pubblicati, questo è stato sviluppato specificamente per accedere a tutto il cervello mentre la mosca si comporta e percepisce da un odore, gusto o stimolazione visiva. Per creare uno slot per la testa.
Dopo aver stampato il supporto con una stampante 3D, posizionare un pezzo di nastro adesivo rettangolarmente su una superficie piana sotto un microscopio stereo. E tagliare un pezzo di circa cinque millimetri per un centimetro. Utilizzare due bisturi fissati insieme in parallelo per tagliare uno slot successivo di 400 per 400 micrometri al centro del lato più lungo del nastro e posizionare il nastro sul lato più piatto del foro sul fondo del supporto.
Utilizzare le forcep per spingere il nastro di circa 500 micrometri intorno al foro. E utilizzare lo smalto nero per coprire la parte superiore del nastro e il supporto. Dopo aver lasciato asciugare lo smalto per almeno un'ora, utilizzare un tessuto arrotolato per aggiungere circa un microlitro di grasso alla fessura della testa.
Per preparare la fessura del corpo, tagliare un pezzo di nastro largo circa due centimetri in due pezzi e tagliare fette larghe 1,5 millimetri. Quindi tagliare una fessura profonda 0,3 millimetri per spalle e corpo e assicurarsi che il nastro si adatti al supporto. Per fissare una mosca nel supporto, posizionare prima un contenitore poco profondo con ghiaccio sotto il microscopio sezionato e posizionare il supporto capovolto su un pezzo di tessuto di laboratorio posto sopra il ghiaccio.
Aspira una mosca di frutta femmina di uno o quattro giorni dalla sua vile e soffia la mosca su ghiaccio non fondeto. Quando la mosca smette di muoversi, utilizzare le forcep Dell per afferrare la mosca alla base delle ali e far scorrere la mosca nel supporto con il collo all'interno della fessura. Gli occhi devono essere ugualmente posizionati su entrambi i lati della fessura.
Se necessario, aggiungere un microlitro di grasso sulla parte superiore della testa per evitare che la colla raggiunga la parte posteriore della testa. Quindi coprire il corpo con un fazzoletto e un po 'di ghiaccio per assicurarsi che la mosca non si muova. Per fissare la testa, posizionarla con un angolo di circa 20 gradi da una vista completamente posteriore.
E utilizzare un tessuto arrotolato per applicare la colla UV intorno alla testa evitando di sporcare l'area sensoriale di interesse. Per gli esperimenti di gusto, utilizzare le forcelle per estrarre la proboscide e aggiungere colla alla base proboscide per prevenire il movimento. Se non è previsto alcun esperimento di gusto, spingere e incollare la proboscide nella testa.
Curare la colla con luce UV per cinque secondi e utilizzare un tessuto arrotolato per pulire con cura le aree che circondano la testa, per rimuovere la colla liquida rimanente che potrebbe attaccarsi al terreno delle gambe e delle porte, aree sensoriali. Quindi utilizzare una sottile striscia di nastro adesivo o un tessuto per spostare le gambe nella parte anteriore se necessario. Per posizionare il corpo, rimuovere il contenitore di ghiaccio e ruotare il supporto.
Rimuovere l'acqua intorno alla mosca e agire rapidamente prima che la mosca si riprenda dall'anestesia posizionare il nastro della fessura del corpo sul foro e spingere delicatamente il corpo della mosca verso il basso, facendo attenzione a non allungare eccessivamente il collo. Coprire tutti i fori di grandi dimensioni rimanenti con nastro adesivo e aggiungere circa un microlitro di grasso sul retro della testa, per evitare che la colla si attacchi in quella posizione. Utilizzare un tessuto arrotolato per dipingere la colla UV intorno al torace e sopra il nastro e il torace e curare la colla con luce UV per circa cinque secondi.
Rimuovere con cura qualsiasi grasso e colla non cartolina con un tessuto da laboratorio e aggiungere circa un millilitro di soluzione salina nella parte superiore della testa. Utilizzare le flessioni per mettere da parte eventuali bolle d'aria e verificare la presenza di perdite posizionando un coperchio scivolare sopra la salina e ruotando il supporto per verificare la presenza di soluzione salina sul lato anteriore. Se si osserva una salina, rimuovere la salina e fissare il foro con più colla o più grasso.
Per sezionare la testa selezionare l'ingrandimento più alto e utilizzare forcep affilate molto fini per effettuare due tagli alla base del triangolo centrale della cuticola scura su ciascun lato del collo. Tagliare intorno al triangolo scuro e rimuovere questa parte della cuticola. Il muscolo 16 e l'esofago dovrebbero essere visibili attraverso questo buco e muoversi ritmicamente.
Utilizzare le forcep molto fini per pizzicare con cura la parte superiore di quest'area per remare il muscolo 16 senza forare l'esofago. Se il movimento ritmico si ferma, il muscolo 16 è stato probabilmente rimosso. Quando il muscolo è stato asportato a partire dal bordo mediale della regione del triangolo scuro, utilizzare le forcep come un paio di forbici per tagliare e rimuovere con cura la cuticola rimanente in piccoli pezzi.
Quindi utilizzare le forcep per afferrare e allontanare lentamente e costantemente un sacco d'aria alla volta. In questo video è stata espressa una sonda di calcio in tutti i neuroni di questi due cervelli di mosca della frutta. E fu presentato un soffio di odore.
In questo esperimento, l'espressione del sensore di calcio era limitata ai neuroni dopaminergici e sierotonergici. Si noti la stretta correlazione tra la forte attività sincrona sul cervello e il comportamento di camminata delle mosche che illustra come l'intero cervello può essere osservato durante un comportamento specifico. Utilizzando l'analisi dei componenti principali e l'analisi indipendente dei componenti è possibile estrarre diverse regioni funzionali evidenziate in diversi colori.
La forma e la localizzazione delle regioni funzionali consentono di mappare le regioni a modelli anatomici. Identificare le regioni cerebrali e, in alcuni casi, i tipi di neuroni. Una volta allineati all'appropriato modello anatomico, i valori di fluorescenza possono essere mediati all'interno di specifiche regioni cerebrali anatomiche per l'analisi quantitativa.
Ad esempio, in questa analisi possiamo osservare che tutte le regioni sono più attive durante le passeggiate che durante la toelettatura. Sii paziente. Imparare questa tecnica di dissezione cardiaca è difficile.
Nel mio laboratorio, le persone hanno bisogno in media da tre a quattro mesi prima di padroneggiarlo e ottenere i primi preparati utili. Seguendo questo protocollo possiamo registrare l'attività cerebrale su larga scala usando un microscopio a fluorescenza. Sono particolarmente indicati metodi veloci come la microscopia a campo luminoso.
