Nosso protocolo permite a imagem de todo o cérebro de mosca durante o comportamento, o que é importante para entender como os neurônios em diferentes áreas cerebrais interagem para moldar o comportamento. Ao contrário de outros protocolos publicados, este foi desenvolvido especificamente para acessar todo o cérebro enquanto a mosca está se comportando e sentindo por um cheiro, paladar ou estimulação visual. Para criar um slot para a cabeça.
Depois de imprimir o suporte com uma impressora 3D, coloque um pedaço de fita adesiva retangularmente sobre uma superfície plana sob um microscópio estéreo. E corte cerca de cinco milímetros por um centímetro de peça. Use dois bisturis fixados juntos em paralelo para cortar uma ranhura de 400 por 400 micrômetros no meio do lado mais longo da fita, e coloque a fita sobre o lado liso do orifício na parte inferior do suporte.
Use fórceps para empurrar a fita aproximadamente 500 micrômetros ao redor do buraco. E use esmalte preto para cobrir a parte superior da fita e o suporte. Depois de deixar o esmalte secar por pelo menos uma hora use um tecido enrolado para adicionar aproximadamente um microliter de graxa à ranhura da cabeça.
Para preparar a ranhura do corpo, corte um pedaço de fita larga de aproximadamente dois centímetros em dois pedaços e corte fatias de 1,5 milímetros de largura. Em seguida, corte uma ranhura de ombro e corpo de 0,3 milímetros e certifique-se de que a fita se encaixa no suporte. Para fixar uma mosca no suporte, primeiro coloque um recipiente raso com gelo sob o microscópio dissecando, e coloque o suporte de cabeça para baixo sobre um pedaço de tecido de laboratório colocado sobre o gelo.
Aspirar uma fruta fêmea de um a quatro dias de idade voar de sua vil, e soprar a mosca em gelo des fundição. Quando a mosca parar de se mover use fórceps Dell para agarrar a mosca na base das asas, e deslize a mosca para dentro do suporte com o pescoço dentro da fenda. Os olhos devem estar igualmente posicionados em ambos os lados da ranhura.
Se necessário, adicione um microliter de graxa na parte superior da cabeça para evitar que a cola atinja a parte de trás da cabeça. Em seguida, cubra o corpo com um tecido e um pouco de gelo para garantir que a mosca não se mova. Para fixar a cabeça, coloque-a em um ângulo de aproximadamente 20 graus a partir de uma visão totalmente posterior.
E use um tecido enrolado para aplicar cola UV ao redor da cabeça, evitando sujar a área sensorial de interesse. Para experimentos de sabor, use fórceps para retirar os proboscis e adicionar cola na base proboscis para evitar o movimento. Se nenhum experimento de gosto for planejado empurre e cole o proboscis na cabeça.
Cure a cola com luz UV por cinco segundos, e use um tecido enrolado para limpar cuidadosamente as áreas ao redor da cabeça, para remover qualquer cola líquida restante que possa grudar nas pernas e portas do solo, áreas sensoriais. Em seguida, use uma fina tira de fita ou um tecido para mover as pernas para a frente, conforme necessário. Para posicionar o corpo, remova o recipiente de gelo e gire o suporte.
Remova a água ao redor da mosca e atuando rapidamente antes que a mosca se recupere da anestesia coloque a fita do slot do corpo sobre o buraco e empurre suavemente o corpo da mosca para baixo, tomando cuidado para não esticar demais o pescoço. Cubra quaisquer furos grandes restantes com fita adesiva e adicione aproximadamente um microliter de graxa na parte de trás da cabeça, para evitar que a cola grude naquele local. Use um tecido enrolado para pintar cola UV ao redor do tórax e em cima da fita e do tórax, e cure a cola com luz UV por aproximadamente cinco segundos.
Remova cuidadosamente qualquer graxa e cola não cicatrizada com um tecido de laboratório e adicione aproximadamente um mililitro de soro fisiológico ao topo da cabeça. Use fórceps para afastar quaisquer bolhas de ar e verificar se há vazamentos colocando um deslizamento de cobertura sobre o soro fisiológico e girando o suporte ao redor para verificar se há soro fisiológico na parte frontal. Se for observado soro fisiológico, remova o soro fisiológico e fixe o orifício com mais cola ou mais graxa.
Para dissecar a cabeça selecione a ampliação mais alta e use fórceps muito finos afiados para fazer dois cortes na base do triângulo de cutícula escura central em cada lado do pescoço. Corte ao redor do triângulo escuro, e remova esta parte da cutícula. O músculo 16 e o esôfago devem ser visíveis através deste buraco e movendo-se ritmicamente.
Use os fórceps muito finos para beliscar cuidadosamente a parte superior desta área para cortar o músculo 16 sem perfurar o esôfago. Se o movimento rítmico parar o músculo 16 provavelmente foi removido. Quando o músculo tiver sido extirpado a partir da borda medial da região do triângulo escuro, use os fórceps como um par de tesouras para cortar cuidadosamente e remover a cutícula restante em pequenos pedaços.
Em seguida, use os fórceps para agarrar e lentamente e constantemente puxar um saco de ar de cada vez. Neste vídeo, uma sonda de cálcio foi expressa em todos os neurônios desses dois cérebros de moscas-das-frutas. E um sopro de odor foi apresentado.
Neste experimento, a expressão do sensor de cálcio foi restrita a neurônios dopaminérgicos e serotonérgicos. Observe a correlação apertada entre a forte atividade síncroca sobre o cérebro e o comportamento de caminhada das moscas ilustrando como todo o cérebro pode ser observado durante um comportamento específico. Utilizando a análise de componentes princípios e a análise de componentes independentes diferentes regiões funcionais destacadas em cores diferentes podem ser extraídas.
A forma e localização das regiões funcionais permite que as regiões sejam mapeadas em modelos anatômicos. Para identificar regiões cerebrais e, em alguns casos, tipos de neurônios. Uma vez alinhados aos valores de fluorescência do modelo anatômico apropriado podem ser mediados dentro de regiões cerebrais anatômicas específicas para análise quantitativa.
Por exemplo, nesta análise podemos observar que todas as regiões são mais ativas durante a caminhada do que durante o preparo. Seja paciente. Aprender essa técnica de dissecção cardíaca é difícil.
No meu laboratório, as pessoas precisam, em média, de três a quatro meses antes de dominá-lo e obter suas primeiras preparações úteis. Seguindo este protocolo, podemos registrar atividade cerebral em larga escala usando um microscópio de fluorescência. Métodos rápidos, como microscopia de campo leve, são particularmente indicados.
