Наш протокол позволяет изображения всего мозга мухи во время поведения, что важно для понимания того, как нейроны в различных областях мозга взаимодействуют, чтобы сформировать поведение. В отличие от других опубликованных протоколов, это было разработано специально для доступа ко всему мозгу в то время как муха ведет себя и чувствует запах, вкус или визуальную стимуляцию. Создать головной слот.
После печати держателя с помощью 3D-принтера поместите кусок липкой ленты прямоугольно на плоскую поверхность под стерео микроскопом. И вырезать примерно пять миллиметров на один сантиметр кусок. Используйте два скальпеля фиксированной вместе параллельно сократить 400 на 400 микрометров следующий слот в середине длинной стороне ленты, и поместите ленту над плоской стороне отверстия на нижней части держателя.
Используйте типсы, чтобы протолкнуть ленту примерно на 500 микрометров вокруг отверстия. И использовать черный лак для ногтей, чтобы покрыть верхнюю часть ленты и держателя. После сдачи лака для ногтей сухой, по крайней мере час использовать проката ткани, чтобы добавить примерно один микролитер жира в голову слот.
Чтобы подготовить слот для тела, разрежьте примерно два сантиметра кусок широкой ленты на две части и разрежьте 1,5 миллиметра в ширину ломтиками. Затем вырежьте 0,3 миллиметра глубокого плеча и тела слот и убедитесь, что лента подходит держатель. Чтобы зафиксировать муху в держателе, сначала поместите неглубокий контейнер со льдом под рассечение микроскопа, и поместите держатель вверх ногами на кусок лабораторной ткани, помещенной над льдом.
Аспирировать от одного до четырех дней самка плодов летит из своей мерзкой, и удар летать на неплавленный лед. Когда муха перестает двигаться использовать Dell типсов, чтобы схватить муху у основания крыльев, и слайд летать в держатель с шеей внутри слота. Глаза должны быть одинаково расположены по обе стороны от слота.
При необходимости добавьте один микролитер смазки в верхней части головы, чтобы предотвратить клей от достижения задней части головы. Затем накройте тело салфеткой и льдом, чтобы убедиться, что муха не двигается. Чтобы обезопасить голову, поместите ее под углом около 20 градусов с полностью заднего вида.
И использовать свернутую ткань для применения УФ-клея вокруг головы, избегая при этом загрязнения сенсорной области интереса. Для вкусовых экспериментов, использовать типсы, чтобы вытащить хоботок и добавить клей на хоботок базы для предотвращения движения. Если нет вкуса эксперимент планируется толчок и клей хоботок в голову.
Лечить клей с ультрафиолетовым светом в течение пяти секунд, и использовать свернутые ткани тщательно очистить области, окружающие голову, чтобы удалить все оставшиеся жидкий клей, который может прилипнуть к ногам и дверям почвы, сенсорные области. Затем используйте тонкую полоску ленты или ткани, чтобы переместить ноги на фронт по мере необходимости. Чтобы распоить тело, снимите ледяной контейнер и поверните держатель вокруг.
Удалите воду вокруг мухи и действовать быстро, прежде чем муха восстанавливается после анестезии место тела слот ленты над отверстием и осторожно толкнул тело мухи вниз, заботясь, чтобы не перенапряжение шеи. Обложка любых оставшихся больших отверстий с лентой и добавить примерно один микролитер жира на задней части головы, чтобы предотвратить клей от прилипания в этом месте. Используйте свернутую ткань для того чтобы покрасить ультрафиолетовый клей вокруг грудной клетки и на верхней части ленты и грудной клетки, и вылечить клей с ультрафиолетовым светом на приблизительно 5 секунд.
Тщательно удалите любой жир и неохващенный клей с лабораторной ткани и добавить примерно один миллилитр солевого раствора в верхней части головы. Используйте типсы, чтобы отодвинуть любые пузырьки воздуха и проверить на наличие утечек, поставив крышку скольжения по солевой раствор и поворота держателя вокруг, чтобы проверить на физраствор на передней стороне. Если солевой раствор наблюдается, удалить солевой раствор и исправить отверстие с более клея или более жира.
Для вскрытия головы выберите наивысшее увеличение и используйте заточенные очень тонкие типсы, чтобы сделать два разреза у основания центрального темного треугольника кутикулы с каждой стороны шеи. Вырезать вокруг темного треугольника, и удалить эту часть кутикулы. Мышцы 16 и пищевода должны быть видны через это отверстие и двигаться ритмично.
Используйте очень тонкие щипцы, чтобы тщательно ущипнуть верхней части этой области, чтобы разорвать мышцы 16 без прокола пищевода. Если ритмическое движение останавливается мышцы 16, скорее всего, удалены. Когда мышца была вырезана, начиная с медиальной кромки области темного треугольника, используйте типсы, как ножницы, чтобы тщательно вырезать и удалить оставшиеся кутикулы на мелкие кусочки.
Затем используйте типсы, чтобы схватить и медленно и неуклонно оторвать один воздушный мешок за один раз. В этом видео кальций зонд был выражен во всех нейронов этих двух плодовых летать мозга. И клубок запаха был представлен.
В этом эксперименте экспрессия датчиков кальция ограничивалась дофаминергическими и серотонергическими нейронами. Обратите внимание на жесткую корреляцию между сильной синхронной активностью над мозгом и поведением мух, идущих, иллюстрирующих, как весь мозг может наблюдаться во время определенного поведения. Используя анализ принципиальных компонентов и независимый анализ компонентов, можно извлечь различные функциональные области, выделенные в разных цветах.
Форма и локализация функциональных областей позволяет сопоставить регионы с анатомическими шаблонами. Для выявления областей мозга, а в некоторых случаях, типов нейронов. После присоединения к соответствующему анатомическому шаблону значения флуоресценции могут быть усредны в пределах конкретных анатомических областей мозга для количественного анализа.
Например, в этом анализе мы можем заметить, что все регионы более активны во время ходьбы, чем во время ухода. потерпеть. Изучение этой техники вскрытия сердца трудно.
В моей лаборатории, люди должны в среднем три-четыре месяца, прежде чем освоить его и получить свои первые полезные подготовительные. Следуя этому протоколу, мы можем записывать крупномасштабную активность мозга с помощью флуоресцентного микроскопа. Особенно показаны быстрые методы, такие как микроскопия светового поля.
