Este enfoque se puede utilizar en modelos de sistemas celulares de estrés del retículo endoplásmico mediante la manipulación de la expresión molecular de los componentes del par aguas abajo. La principal ventaja de esta técnica es eliminar el impacto de la señalización pareada mediante la visualización y medición de las vías neuronales. Este método puede contribuir a comprender las bases moleculares de la transición entre las fases aguda y crónica del estrés en el RE en diversos modelos de enfermedades neurodegenerativas además de la gangliosidosis GM2 Para comenzar, disecciona el tejido bajo una lupa 20X con dos pinzas de punta fina número cinco, separando la corteza frontal de las meninges.
Transfiera la corteza frontal a un tubo cónico de 15 mililitros e incube el tejido con tres a cuatro mililitros de tripsina EDTA durante 15 minutos a 37 grados centígrados para la digestión química. Después de eso, lávelo tres veces con la solución salina equilibrada de Hank sin iones de calcio y magnesio y 0.1% de glucosa. Disociar mecánicamente el tejido 10 veces pipeteando hacia arriba y hacia abajo usando una punta de 1.000 microlitros en DMEM más 10% FCS.
Centrifugar el homogeneizado a 100 G durante un minuto, recoger el sobrenadante y completar el volumen restante en 1.000 microlitros. Coloque la suspensión celular en placas de cultivo celular a una densidad de 520 células por milímetro cuadrado con dos mililitros de DMEM que contengan 10% de FCS, 1% de estreptomicina de penicilina y 1% de un aditivo de aminoácido esencial. Incubar a 37 grados centígrados en un ambiente humidificado con 5% de dióxido de carbono durante dos horas.
Para permitir la diferenciación de las células neuronales, cambie el medio por un medio neurobasal sin suero con el suplemento sin suero. Mantenga los cultivos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono hasta el tratamiento. Para el recocido, mezclar dos oligonucleótidos monocatenarios con secuencias complementarias en cantidades molares iguales.
Calentar a 95 grados centígrados durante dos minutos. Transfiera las muestras del bloque de calor y diluya el producto resultante a una concentración final de 0,5 micromolar. Para clonar el shRNA inserte en el vector lentiviral pLKO.
3G, digiere un microgramo del vector con enzimas de restricción EcoR1 y PAC1. Mezclar suavemente pipeteando e incubar la reacción durante tres o cuatro horas a 37 grados centígrados. Para la ligadura, mezcle el vector digerido e insértelo en una proporción molar de 3: 1.
Incubar con la ligasa T4 y el amortiguador de ligasa durante la noche a 16 grados centígrados. A continuación, mezcle el componente E. coli con el volumen total de la reacción de ligadura y enfríelo en hielo durante 15 minutos. Colóquelo en un baño de 42 grados centígrados durante dos minutos y luego enfríelo en hielo nuevamente durante 15 minutos.
Transfiera el volumen total sometido a choque térmico a un tubo de 15 mililitros y complete el volumen a 1, 000 microlitros con Luria-Bertani, o medio líquido L-B. Agite las bacterias durante 90 minutos de 37 grados centígrados en un agitador orbital a aproximadamente 330 RPM. Centrífuga que alcanzó 5, 000 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche 900 microlitros del sobrenadante y use el sobrenadante restante para resuspender el pellet. Extienda la suspensión de bacterias uniformemente sobre una placa sólida de ampicilina L-B e incube durante 37 grados centígrados durante la noche. Elija una sola colonia para transferir a un tubo de 15 mililitros con 10 mililitros de medio líquido L-B y ampicilina.
Agitar las bacterias a 37 grados centígrados a aproximadamente 330 RPM y centrifugar el cultivo para granular las bacterias a 5, 000 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante, conserve el pellet bacteriano a menos 20 grados centígrados. 24 horas antes de la transfección, siembre de 1 a 5 millones de células HEK-293 en placas de cultivo de 100 milímetros.
Mezclar 14 microgramos de pKLO. Vector 3G con un inserto específico, 10,5 microgramos de plásmido de empaquetamiento psPAX y 3,5 microgramos de plásmido de sobre pMD2. G.Diluir 45 microlitros de reactivo de transfección plásmido en 700 microlitros de medio sérico reducido e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Luego combine la mezcla de ADN con el reactivo de transfección de plásmido diluido, mezcle suavemente e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Cambie el medio de la placa de cultivo de células HEK-293 con un medio fresco después de la transfección y agregue todo el volumen de la solución de ADN gota a gota. Mece el plato suavemente e incuba las células a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono durante 48 a 72 horas para permitir que los shRNAs alcancen su transducción óptima.
Recoja el medio con lentivirus y guárdelo a cuatro grados centígrados. Filtre el sobrenadante viral con una membrana de nylon de 0,45 micrómetros y alícuota un milímetro del flujo. Centrifugar a 17, 000 G durante cuatro horas.
Desechar el sobrenadante y conservar el pellet. Deje que el pellet invisible se seque y, una vez seco, guárdelo a menos 80 grados centígrados. Infectar los cultivos primarios de neuronas corticales con oligonucleótidos específicos de shRNA, dirigidos a los tres UTR primarios de calcineurina A-alfa o CHOP e incubarlos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante un día.
Después de eso, agregue la solución madre GM2 al medio de la placa de cultivo a una concentración final de dos micromolares e incube a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 16, 24 y 48 horas. Fije las células con paraformaldehído al 4% y sacarosa 120 milimolar en PBS durante 20 minutos a 37 grados centígrados y luego lávelas con PBS. Agregue la solución de permeabilización durante cinco minutos y lave con PBS.
Use 5% BSA diluido en PBS durante 45 minutos para permitir el bloqueo. Luego, incubar con el anticuerpo anti-MAP2 a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de lavar las células dos veces con PBS al final del tiempo de incubación, incubar con un anticuerpo secundario durante una hora.
Monte las gafas después de lavar las celdas con PBS. Después de obtener las imágenes con un microscopio invertido de epifluorescencia cargar la imagen para obtener ImageJ y restar el fondo haciendo clic en Proceso seguido de Restar fondo. Haga clic en Imagen, Ajustar, Umbral para ajustar los valores mínimos, permitiendo distinguir la ruta y algunos trazados.
Eliminar somas usando la selección a mano alzada. Seleccione Trazas y haga clic en Editar, Selección, Crear selección. Obtenga el ROI haciendo clic en las teclas Control y T de la selección y guárdelo.
Abra la imagen original. Haga clic en el panel ROI Manager y seleccione el ROI inicial. Luego haga clic en la imagen original.
Una vez que el ROI se traza en la imagen, presione control y teclas M para procesar el análisis estadístico. Aquí se intentó verificar si el silenciamiento de los componentes posteriores de 2pERK afecta la fase de transición de la respuesta de la proteína desplegada en el modelo de células de estrés ER. El gen de la calcineurina A-alfa y el gen CHOP fueron silenciados por dos secuencias específicas de shRNA en un cultivo de células neuronales primarias durante un día.
La expresión es analizada por Western blotting. Se observa una clara inhibición del aumento del nivel de calcineurina A-alfa mediado por el estrés del RE y CHOP en las células de derribo. El posible vínculo del estrés ER inducido por la acumulación de GM2 con la degeneración neuronal se examinó mediante la realización de inmunotinción MAP2 de cultivos neuronales primarios.
La atrofia de neuritas aumenta significativamente después de inducir estrés en el RE por incubación de GM2 a las 16 a 48 horas. El silenciamiento de la expresión de calcineurina A-alfa aumenta significativamente la atrofia de las neuritas, particularmente a las 16 horas de la acumulación de GM2 en relación con los grupos GM2 no tratados. Por lo tanto, la eliminación de la calcineurina A-alfa aceleró el proceso de degeneración en las neuronas, corroborando el efecto pro-supervivencia de la calcineurina durante la fase temprana de la respuesta de la proteína desplegada.
Por el contrario, la eliminación de CHOP resultó en una disminución significativa de la atrofia de neuritas en relación con los controles precisamente a las 16 a 24 horas. el protocolo celular con el cultivo celular primario adecuado y obteniendo un porcentaje de 90 o más de células infectadas con el lentivirus respectivo. Como la pérdida del axón terminal neural es el primer paso que establecemos en nuestro proceso, también es posible evaluar esto realizando un ensayo.
Esta técnica permite a nuestro grupo y a otros evaluar algunas moléculas como posibles herramientas terapéuticas.
