El Ommaya murino, que imita el reservorio de Ommaya utilizado clínicamente, permite a los investigadores probar una variedad de terapias dirigidas directas para las metástasis cerebrales y la enfermedad leptomenísica universalmente fatal en un modelo preclínico. La ventaja de esta técnica es que los investigadores pueden administrar un volumen de microlitros de medicamentos directamente en el líquido cefalorraquídeo para tratar las metástasis del sistema nervioso central, evitando la barrera hematoencefálica. Este protocolo de implantación de Ommaya murino está diseñado para investigadores o técnicos que tienen experiencia en cirugía estereotáctica y entrenamiento en técnicas asépticas, que son esenciales para garantizar el éxito de este procedimiento.
Demostrando el procedimiento estarán Margie Baldwin y Michelle Danielson de Medicina Comparada en la Universidad del Sur de Florida, y Vincent Law, un investigador asociado senior del laboratorio del Dr. Peter Forsyth en el Centro de Cáncer Moffitt y el Instituto de Investigación. Comience inyectando al ratón por vía subcutánea con un miligramo por kilogramo de buprenorfina de liberación sostenida. Después de anestesiar al ratón, prepárelo para la cirugía.
Recorte el sitio quirúrgico con suficiente área de borde para evitar que el pelaje contamine el sitio de la incisión. Afeitar el pelaje de toda la superficie de la cabeza y preparar la piel con técnica estéril. Luego saturar el sitio con antiséptico de piel germicida, trabajando desde el centro del sitio hasta la periferia, y dejar que se seque.
Coloque el cuerpo para asegurarse de que la columna vertebral se mantenga nivelada con la cisterna magna. Mientras aplica una ligera tracción a la cola, coloque cinta adhesiva en la base de la cola para asegurarla. Aplique una cortina estéril o un material de cortina plástica estéril con respaldo adhesivo para proteger el sitio quirúrgico de la contaminación.
Con el cuello en plena extensión, ejecute las puntas de la tijera quirúrgica hacia abajo con una ligera presión a través del hueso occipital, comenzando justo entre las pinnas. Haga una pequeña incisión de tres a cinco milímetros en la línea media, ligeramente por encima de la concavidad palpada. Extraiga cinco microlitros de la suspensión celular en una jeringa Hamilton de calibre 30.
Use forrórceps de punta roma con una punta de uno a dos milímetros para presionar suavemente la cisterna magna. Introduzca las puntas en una posición cerrada y ábralas mientras aplica presión hacia abajo sobre la duramadre. Repita la disección roma hasta que la membrana dural se identifique fácilmente y los vasos sanguíneos asociados sean visibles en el área expuesta.
Mientras mantiene las fórceps abiertas para retraer la musculatura circundante, introduzca una aguja sin perforación de calibre 30 debajo de la duramadre para visualizar el bisel, asegurándose de que la aguja solo se introduzca justo más allá del bisel en sí. Despliegue lentamente un émbolo de jeringa y entregue células justo debajo de la duramadre. Si se observa una fuga en el sitio de inyección, aplique una presión suave con un aplicador con punta de algodón.
Cierre la piel aplicando un clip para heridas o una micro gota de adhesivo para la piel. Monitoree a los ratones diariamente después de la cirugía durante la primera semana. Si un ratón parece tener dolor o angustia, trátelo con una inyección subcutánea de 10 miligramos por kilogramo de carprofeno una vez cada 12 a 24 horas durante un período de hasta cinco días según la consulta veterinaria y la directiva.
Ensamble el dispositivo de inyección Murine Ommaya utilizando un puerto de inyección en miniatura de calibre 25 y un disco espaciador de un milímetro. Use un adhesivo estéril de cianoacrilato para asegurar la penetración de aproximadamente 2,5 milímetros de la cánula metálica en el hemisferio cerebral derecho, y prepare la piel de acuerdo con la técnica estéril. Haga una pequeña incisión en la piel seguida de una disección contundente de los tejidos subcutáneos subyacentes para exponer el cráneo.
Seque el cráneo con palitos aplicadores de punta de algodón empapados en peróxido de hidrógeno. Perfore un orificio de rebaba de 0,9 milímetros en el cráneo 0,5 milímetros posterior y 1,1 milímetros lateral del bregma para exponer la materia dura. Mueva el microdrill a un lado y puntúe suavemente el hueso que rodea inmediatamente el orificio de rebaba.
Coloque un puerto de inyección en el cráneo con un adhesivo estéril de cianoacrilato e insértelo a una profundidad de aproximadamente 2,5 milímetros. Sutura la incisión con 4-0 suturas de nylon no absorbibles en un patrón de puntada interrumpido o sutura con cuerda de bolso. Alojar ratones postoperatorios en jaulas individuales para su recuperación.
Para dosificar el ratón, acceda al Murine Ommaya utilizando un adaptador de inyección de puerto y una jeringa Hamilton. Con pinzas, sostenga la parte superior del puerto de inyección en miniatura e inserte suavemente el adaptador del inyector de puerto completamente en el tabique del puerto. Una vez realizada la inyección, separe el Murine Ommaya del adaptador de inyección de puerto con pórceps.
Con el fin de visualizar la ruta de la inyección, se inyectó 2%Evans Blue a través del modelo Murine Ommaya. El tinte se infiltró con éxito en los ventrículos y el cerebro en 15 minutos. Después de 30 minutos, el tinte se hizo visible en la médula espinal.
Como prueba de concepto, se inyectó a ratones BALB/c una línea celular de cáncer de mama Her2+TUBO con etiqueta luciferasa intratracisternalmente, y se implantaron las Ommayas murinas. Aproximadamente una semana después de la inyección, los ratones comenzaron a desarrollar LMD. Estos ratones fueron tratados una vez a la semana durante un período de hasta cuatro semanas con inmunoterapia con anticuerpos Her2, ya sea a través de terapia sistémica mediante inyección intraperitoneal o intratecalmente a través del Ommaya murino.
Mientras que los ratones no tratados murieron al día 19, todos los ratones que recuperaron la terapia intratecal a través del Ommaya murino sobrevivieron. En la cuarta semana, se observó una regresión completa de los tumores. En comparación con los ratones tratados con terapia sistémica, los ratones que recibieron terapia intratecal tuvieron una supervivencia general mucho más larga.
Al intentar este procedimiento, es importante que el cráneo esté seco antes de colocar la Ommaya murina. Use una pequeña cantidad de pegamento y coloque el Ommaya murino durante unos 10 segundos para adherirse al cráneo. Con esta técnica, los investigadores pueden explorar una amplia gama de medicamentos contra el cáncer en modelos de ratón que son clínicamente relevantes para diseñar estrategias terapéuticas racionales para pacientes con metástasis del sistema nervioso central.
