Este protocolo proporciona un enfoque preclínico para descubrir y validar tratamientos farmacéuticos para las enfermedades metabólicas de la retina directamente dentro del tejido retiniano humano. Esta técnica combina la complejidad del metabolismo en los tejidos humanos con la versatilidad y el rendimiento del cultivo celular. Hemos utilizado este ensayo para adquirir datos preclínicos para el tratamiento de la enfermedad degenerativa de la retina, MacTel, utilizando un fármaco alterador de lípidos común y seguro, fenofibrato, que ahora se encuentra en ensayos clínicos de seguridad.
Este enfoque se puede aplicar a cualquier número de factores estresantes retinianos comunes que conducen a enfermedades, incluida la deficiencia de nutrientes, hipoxia, toxicidad lumínica y otros lípidos tóxicos. En la semana 24 de cultivo, revise los organoides para detectar la formación de segmentos rudimentarios en el exterior del organoide. Para la semana 26 a 28, los segmentos externos deberían haber formado una capa gruesa.
Cuando se pueda observar un segmento escéptico engrosado, diluir una solución madre de desoxiSA milimolar a 0,51. Una y dos concentraciones micromolares en tres mililitros de medio de diferenciación retiniana más. Usando un microscopio de disección y una sonda estéril, seleccione cuatro grupos de organoides de aproximadamente el mismo tamaño y forma con un mínimo de cinco organoides por grupo, y divida los grupos en pocillos individuales de una placa de 6 pocillos de unión ultrabaja.
Cuando se hayan recolectado todos los organoides, retire la mayor cantidad posible de medio de cada pocillo y agregue una concentración de la solución de desoxiSA a cada pocillo. Agregue el control del vehículo al cuarto grupo de organoides. Después de dos días de cultivo, reemplace los sobrenadantes de cultivo con el desoxiSA fresco apropiado o la dilución de control.
Después de cuatro días de cultivo, incrustar la criosección y teñir los organoides de acuerdo con los protocolos estándar para permitir la evaluación de la muerte celular dentro de cada cultivo. Después de la tinción, use un aumento de cinco a 10x para localizar una región de la sección organoide cortada que esté intacta, bien formada y en un plano que muestree una sección transversal representativa del organoide. La sección debe tener una capa nuclear externa distinta de fotorreceptores que tenga al menos unas pocas células de espesor, y una capa separada y distinta de núcleos que no tengan recuperación y tinción.
Encuadre la imagen y aumente la ampliación a 20x. A continuación, encuadre la diapositiva de nuevo para rellenar la imagen con la mayor cantidad posible de la capa fotorreceptora. Defina el plano Z y establezca los límites inferiores del extremo superior del rango Z para obtener imágenes de toda la profundidad del sector.
A continuación, cree una imagen de los tres canales de fluoróforo en una adquisición de pila Z y guarde la imagen en un formato de archivo que conserve la proporción de área por píxel. Para cuantificar el número de células muertas en cada muestra, abra las pilas de imágenes en Fiji. En la ventana de opciones de importación del formato de bio, confirme que no hay casillas marcadas en la sección de división en ventanas separadas y seleccione Imagen, Pilas y Proyecto Z para crear una nueva imagen para la cuantificación.
Seleccione el canal de imagen que muestra la recuperación y tinción y utilice la herramienta de selección de polígonos para delinear una región continua de fotorreceptores en la imagen. Haga clic en Analizar y establecer medidas y seleccione el cuadro Área. Haga clic en Analizar y medir, para medir el área de los fotorreceptores, para contar las células moribundas.
La medición aparecerá en una ventana emergente. Para contar los núcleos positivos de apoptosis en la región fotorreceptora seleccionada, haga clic derecho en la herramienta de punto para seleccionar la herramienta multipunto y seleccione la tinción positiva de apoptosis que se superpone con un núcleo DAPI positivo y recuperar y teñir. Alterna entre los canales para validar las células positivas.
Luego divida el número de células positivas para la apoptosis por el área para obtener un valor normalizado para la muerte celular dentro de los fotorreceptores por organoide. Después de determinar la concentración de deoxySA que induce la muerte de la célula diana, utilice una sonda estéril para seleccionar tres grupos de organoides de aproximadamente el mismo tamaño y forma con un mínimo de cinco organoides por grupo. Y agregue los grupos a pocillos individuales de una placa de 6 pocillos de fijación ultra baja.
Añadir la concentración de muerte celular diana de deoxySA, la concentración de muerte celular diana de deoxySA suplementada con el fármaco de interés o el medio de control al pocillo u organoides apropiados. Después de dos días, reemplace el sobrenadante en cada pocillo con la concentración adecuada de tratamiento fresco o medio de control. Después de cuatro días de cultivo, evaluar los cultivos para la muerte celular como se demostró.
En este análisis representativo, los organoides retinianos generados a partir de una línea de células madre pluripotentes inducida por control de telangiectasia no macular tipo 2 se trataron con cuatro concentraciones de deoxySA. La muerte celular en respuesta a deoxySA fue dependiente de la concentración y detectable en tan solo 50 nanomolares de desoxySA. La concentración más alta probada indujo una muerte celular robusta mientras se mantiene la integridad del organoide retiniano.
El tratamiento con fenofibrato 20 micromolares evitó la toxicidad inducida por deoxySA en los fotorreceptores de los organoides retinianos, reduciendo significativamente la muerte celular en aproximadamente un 80% después de cuatro días de tratamiento. Recuerde seleccionar organoides bien formados y sanos para asegurarse de que el ensayo se realiza en células de la retina. Los organoides pueden ser procesados para la recolección de ARN para cuantificar la expresión génica, permitiendo la evaluación de señales de estrés y la validación de efectos tóxicos y rescates.
Usando esta técnica, hemos podido evaluar el metabolismo posterior de múltiples lípidos diferentes en organoides, abriendo el estudio del metabolismo de los lípidos en las retinas humanas.
