Este protocolo utiliza análisis histológicos para obtener mediciones morfométricas robustas de heridas por escisión de ratón. Usando esta técnica, podemos analizar toda la herida usando un subconjunto de secciones seriales, permitiéndonos detectar con mayor precisión defectos que de otro modo podrían perderse. Demostrando el procedimiento estará Lindsey Rhea, una investigadora asociada de mi laboratorio.
Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal en un ratón adulto anestesiado, aplique un ung ón en los ojos del animal y utilice un cortaca afeitar eléctrico en un movimiento caudal-rostral para eliminar el pelaje en la parte posterior del ratón a nivel del hombro. Usa una cuchilla de afeitar sostenida en un ángulo de 20 grados desde la espalda en un movimiento rostral-caudal para eliminar cualquier cabello restante de la piel expuesta, luego limpia la piel con un yodo povidona y una toallita de preparación de alcohol isopropílico al 70%. Para la inducción de la herida, cubra una toalla limpia a base de papel sobre una superficie plana cubierta con cera dental y coloque el ratón sobre la toalla en la posición propensa.
Pincha la piel del ratón entre los omóplatos a lo largo de la línea media dorsal y tira del pliegue de la piel empareda lejos del cuerpo. Cambiando el ratón a una posición lateral, coloque un puñetazo de biopsia del tamaño de la herida deseado lo más cerca posible del cuerpo y permita que la piel se relaje. Presione hacia abajo en el punzón usando un movimiento de balanceo para perforar todas las capas de la piel y retire las biopsias de punzón de la herida usando tijeras estériles y pinzas para liberar el puñetazo de la piel circundante según sea necesario.
A continuación, permita que el ratón se recupere con monitoreo y analgesia. Para el análisis morfométrico del lecho de la herida, abra una imagen digital de la herida teñida. Para establecer las preferencias de escala y medición, en Analizar, seleccione Establecer escala e introduzca la distancia en píxeles, la distancia conocida y la unidad de longitud.
Seleccione Global y Aceptar para mantener la misma escala para cada imagen abierta y seleccione Analizar y establecer medidas para confirmar que el cuadro de área está activado. Para medir la longitud de la herida, seleccione a mano alzada y utilice la herramienta para trazar a lo largo de la unión dérmica-epidérmica, comenzando desde el último folículo piloso del tejido no lesionado en un lado de la herida hasta el primer folículo piloso del tejido no lesionado en el otro lado. Si la epidermis no cubre toda la herida, siga la unión dérmica-epidérmica en un lado de la herida donde termina la lengua migratoria y continúe siguiendo el aspecto superior del tejido de granulación o la unión entre el tejido de granulación y la costra hasta que se alcance la lengua migratoria y el primer folículo piloso del tejido no lesionado en el otro lado de la herida.
A continuación, haga clic en Analizar y medir. La longitud de la medida aparecerá en las mismas unidades establecidas en la escala. Si la epidermis no cubre toda la herida, mida la distancia entre cada borde delantero epidérmico siguiendo el aspecto superior del tejido de granulación o la unión entre el tejido de granulación y la costra hasta el primer folículo piloso.
Para medir el área de la herida, utilice la herramienta a mano alzada para trazar a lo largo del aspecto superior de la epidermis o el aspecto superior del tejido de granulación a partir del último folículo piloso del tejido no lesionado en un lado de la herida hasta el primer folículo piloso del tejido no lesionado en el otro lado. Continúe trazando verticalmente a lo largo del folículo piloso en el tejido de granulación. Una vez alcanzado el folículo piloso opuesto y el tejido adiposo o el músculo, siga el borde inferior del tejido de granulación hacia el lado opuesto de la herida y únase al punto de partida a lo largo del folículo piloso para cerrar el área.
Si la herida no está completamente epitelializada, trace a lo largo del aspecto superior de la epidermis hasta el borde de ataque y regrese al punto de partida después de la unión dérmica-epidérmica. Como se ilustra, al tomar mediciones 2D a lo largo de toda la herida, pudimos calcular parámetros no posibles con el análisis 2D en el medio de la herida solamente, que es un método comúnmente utilizado en el campo. En este experimento, se utilizaron mediciones 2D del área de la herida y promediaron toda la herida o un subconjunto medio de la herida y no revelaron ninguna diferencia significativa entre los grupos experimentales o los métodos de análisis.
El volumen calculado de la herida, sin embargo, fue significativamente diferente entre los grupos experimentales, demostrando la importancia de un análisis histológico en profundidad de los parámetros de cicatrización de heridas. La generación de heridas de tamaño constante para el análisis histológico y la realización de un riguroso corte en serie son fundamentales para un análisis morfométrico preciso. Las secciones no manchadas se pueden utilizar para la inmunofluorescencia o la tinción tricroma de Masson para medir otros aspectos de la cicatrización de heridas, mientras que las heridas congeladas flash se pueden utilizar junto con la morfometría para el análisis cuantitativo de proteínas.
