Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de reparación y regeneración de tejidos sobre las asociaciones entre las vías citoprotectoras, el estrés oxidativo y la respuesta de cicatrización de heridas. La principal ventaja de esta poderosa técnica es que se pueden medir especies reactivas de oxígeno en una herida, en tiempo real, para determinar su impacto en la regeneración tisular. Demostrando el procedimiento conmigo estará Jennifer Kwong, una asistente de investigación en mi laboratorio.
Utilice un glucómetro para medir la glucosa en sangre de cada ratón diabético anestesiado de ocho a 12 semanas de edad. Y usa un recortador de cabello y crema depilatoria para eliminar el pelo dorsal del primer animal. Use toallitas de alcohol dos veces para limpiar la piel expuesta y cubrir al animal de modo que solo el área quirúrgica quede expuesta.
Cuando el alcohol se haya secado, utilice puñetazos estériles de biopsia de 10 milímetros para crear dos heridas de espesor completo de 10 milímetros que se extienden a través del panniculus carnosus de acuerdo con una técnica de cicatrización de heridas escisional bien establecida. Utilice una hoja de silicona de 0,5 milímetros de espesor con recortes circulares de 10 milímetros para abrir las heridas y asegurar las heridas con suturas de seda 4/0 interrumpidas. A continuación, coloque los ratones en una almohadilla de calor con monitoreo hasta la recuperación completa, antes de regresar a su jaula individual, proporcionando toallas de papel como material de anidación adicional durante dos semanas.
Al día siguiente, aplicar ya sea el control sin sentido pequeño gel de ARN interferente o experimental pequeño gel De Keap1 que interfiere en la parte superior de la herida de cada animal y envolver cada torso con apósito de película transparente para mantener el gel en su lugar mientras deja las extremidades libres. En el tercer día del experimento, cargue una jeringa de un milímetro equipada con una aguja de calibre 27 con solución L-012 recién preparada y envuelva la jeringa para proteger la solución de la luz. Para tomar imágenes de las heridas, retire suavemente el apósito de película transparente de cada uno de los ratones sin molestar las heridas y coloque los ratones en la cámara de imágenes de un sistema de imágenes de bioluminiscencia.
Establezca la entrada del sistema de imágenes y los niveles de oxígeno de la cámara de inducción en un litro por minuto e imagine los ratones por bioluminiscencia y campo brillante al inicio. A continuación, limpiar el abdomen con toallitas de alcohol y luego inyectar cinco miligramos de L-012 solución por 200 gramos de peso corporal, IP, en cada ratón una vez que el alcohol se ha secado. Inyectar la solución L-012 sin perturbar las heridas en la piel dorsal es fundamental, ya que cualquier distorsión afectará a la trayectoria de cicatrización de la herida y a la interpretación de los datos.
Asegúrese de que el animal esté firmemente en la reclinación dorsal antes de la inyección. Inmediatamente después de la inyección, coloque los ratones de nuevo en sus respectivos lugares en la cámara de imágenes e imagine a los animales durante un minuto cada cuatro minutos durante un período de imágenes de 60 minutos, definiendo la herida de 10 milímetros como la región de interés para determinar el nivel de especies reactivas de oxígeno. A continuación, coloque los ratones en una almohadilla de calor con monitoreo hasta la recuperación completa antes de devolver los animales a sus jaulas individuales.
Tres días después de crear heridas bilaterales según el modelo de herida por escisión establecido, no se observa bioluminiscencia antes de la inyección de L-012. Tras la inyección intraperintoneal de la solución L-012, se observa bioluminiscencia en las áreas de la herida donde se detectan especies reactivas de oxígeno. El registro de la bioluminiscencia durante un minuto cada cuatro a cinco minutos en el transcurso de 60 minutos demuestra la saturación bioluminiscente de la región de interés a lo largo del tiempo, con el tiempo óptimo de imagen para alcanzar la saturación completa de L-012 observada en unos 50 minutos.
La bioluminiscencia en cada región de la herida de interés antes y después de la inyección de L-012 en un pequeño ARN interferente sin sentido tratado o Keap1 pequeños ratones tratados con ARN interferente se pueden calcular dividiendo los recuentos totales de intensidad de la luz por el área. El análisis de las secciones del tejido de la herida del día 10 para confirmar la precisión de la medición reactiva del nivel de las especies de oxígeno mediante tinción H&E revela una infiltración celular reducida en pequeñas heridas tratadas con Keap1 que interfieren en comparación con pequeños tejidos tratados sin sentido que interfieren, lo que indica una morfología inflamatoria reducida en los animales tratados con gel experimental. El análisis de la inmuno-reactividad de F4/80, un marcador de macrófagos proteicos en secciones del tejido de la herida, indica un número reducido de macrófagos en pequeñas heridas tratadas con Keap1 que interfieren en comparación con pequeñas heridas tratadas sin sentido que interfieren, subrayando aún más la validez de este método.
Al intentar este procedimiento, asegúrese de confirmar que el L-012 no ha caducado y de agitar la solución en un lugar protegido de la luz. Después de este procedimiento, se pueden utilizar sondas dirigidas y métodos basados en inmunoensayos para estudiar la localización subcelular de especies reactivas de oxígeno y sus correlatos, lo que permite una evaluación rápida de las intervenciones y mecanismos que afectan a los estadísticas redux de las heridas.
