Este protocolo permitirá a los investigadores aprovechar las herramientas químicas y genéticas disponibles para estudiar los mecanismos de regeneración hepática en el pez cebra. Hepatectomy parcial permite el retiro exacto del tejido para estimular la regeneración del hígado sin la necesidad de los efectos cuerpo-anchos de lesión del higado tóxica. Solamente entendiendo los mecanismos moleculares y celulares de la regeneración del hígado podemos diseñar nuevas terapias para tratar a pacientes con enfermedad del higado avanzada.
Para comenzar, retire los peces del tanque Tricaine usando pezórceps e incorpórelos en el surco de una esponja empapada de Tricaine con el lado ventral hacia arriba. Luego coloque la esponja bajo un microscopio de disección con iluminación de arriba hacia abajo. Pellizque la piel y las escamas justo después del corazón con pinzas finas y cree un agujero en la cavidad corporal haciendo un corte debajo de las pinzas con la tijera cargada de resorte.
Gire la esponja y haga una incisión de tres a cuatro milímetros a lo largo del abdomen cortando posterialmente hacia las aletas pélvicas. A continuación, gire la esponja hacia atrás. Apriete los lados de la esponja con una mano para forzar los órganos viscerales a salir de la cavidad corporal.
El lóbulo ventral del hígado está presente en la parte superior del intestino, y el hígado es una estructura rosada o naranja extendida sobre el intestino marrón dorado, y se puede visualizar claramente con fluorescencia CFP. Apriete las esobrtesis finas para que los dientes se toquen entre sí y deslice los dientes entre el hígado y el intestino. Luego, separe lentamente los dientes para romper los accesorios de la vena porta entre el hígado y el intestino.
Repita este proceso hasta que se hayan cortado todas las conexiones portales entre el hígado y el intestino, y tire del lóbulo ventral del intestino usando pórceps finos. Corte el lóbulo ventral libre del resto del hígado. La examinación del animal con fluorescencia de la PPC demuestra que el lóbulo ventral se ha quitado.
Cuando termine, transfiera cuidadosamente el pez de la esponja al tanque que contiene agua del sistema y transmita el agua del sistema sobre las branquias durante unos minutos hasta que el pez se recupere y nade por sí solo. Después de la eutanasia de los peces, retírelo del agua helada. Colóquelo en el surco de una esponja con el lado ventral hacia arriba y haga una incisión de la pared del cuerpo ventral en la posición posterior anterior del corazón.
Luego haga dos incisiones más desde los bordes de la primera incisión que se ejecutan a lo largo del eje posterior anterior hasta las aletas pélvicas, y desprenda la piel y el músculo para revelar los órganos viscerales. Los órganos viscerales ahora se pueden visualizar con microscopía de campo brillante y fluorescencia. La recuperación del hígado después del hepatectomy parcial fue estimada calculando el ratio del hígado al peso corporal, que era 1,8% para los varones y 3,3% para las hembras.
El hígado al ratio del peso corporal de ambos sexos fue determinado en el día cero de la poste-cirugía, y el día siete en controles hepatectomy y del impostor parciales. En el día cero de la poste-cirugía, los animales ficticios tienen un lóbulo ventral visible, pero en animales hepatectomy parciales, el lóbulo ventral estaba totalmente ausente, que dio lugar a una reducción del 30% en varones y a una reducción del 20% en hembras del hígado a los ratios del peso corporal. En el día siete de la poste-cirugía en animales hepatectomy parciales, el lóbulo ventral no fue regenerado, y el hígado a los ratios del peso corporal en controles hepatectomy y del impostor parciales era comparable, indicando la masa recuperada del hígado después de hepatectomy parcial.
El efecto del tiempo sobre la regeneración del lóbulo ventral fue determinado realizando un hepatectomy parcial completo 1/3 y midiendo el lóbulo ventral al ratio de la longitud del intestino. El lóbulo ventral ocupó 50 a el 100% de la longitud del intestino en controles del impostor, pero fue reducido seriamente en animales hepatectomy parciales del 1/3. Los animales hepatectomy parciales en el día 36 de la poste-cirugía tenían un cociente ventral creciente del lóbulo a del intestino con respecto al día uno de la poste-cirugía.
Un tamaño creciente estadístico significativo del lóbulo ventral fue observado en los animales que se recuperaban de hepatectomy parcial en el día 36 de la poste-cirugía con respecto al día uno, pero no en controles del impostor. Algunos animales regeneraron el lóbulo ventral, pero otros no, lo que indica una variación en la respuesta a la cirugía. La parte más crítica de este protocolo es separar limpiamente el hígado y el intestino para que el lóbulo ventral se pueda quitar totalmente.
La hepatectomía parcial en pez cebra se puede realizar en líneas mutantes o transgénicas para probar que los requisitos genéticos para la regeneración hepática.
