Dieses Protokoll wird es den Forschern ermöglichen, die verfügbaren chemischen und genetischen Werkzeuge zu nutzen, um die Mechanismen der Leberregeneration bei Zebrafischen zu untersuchen. Die partielle Häpatektomie ermöglicht die präzise Entfernung von Gewebe, um die Leberregeneration zu stimulieren, ohne dass die körperweiten Auswirkungen einer toxischen Leberschädigung erforderlich sind. Nur durch das Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen der Leberregeneration können wir neue Therapien zur Behandlung von Patienten mit fortgeschrittener Lebererkrankung entwickeln.
Um zu beginnen, entfernen Sie die Fische aus dem Tricain-Tank mit einer Zette und betten Sie sie mit der ventralen Seite nach oben in die Rille eines mit Tricain getränkten Schwamms ein. Dann legen Sie den Schwamm unter ein Seziermikroskop mit Top-Down-Beleuchtung. Kneifen Sie die Haut und die Schuppen nur nach hinter dem Herzen mit einer feinen Zette und erzeugen Sie ein Loch in der Körperhöhle, indem Sie mit der federbelasteten Schere einen Schnitt unter der Ziffe machen.
Drehen Sie den Schwamm und machen Sie einen Drei- bis Vier-Millimeter-Schnitt entlang des Bauches, indem Sie nachträglich in Richtung der Beckenflossen schneiden. Dann drehen Sie den Schwamm zurück. Drücken Sie die Seiten des Schwammes mit einer Hand zusammen, um die viszeralen Organe aus der Körperhöhle zu drücken.
Der Bauchlappen der Leber ist oben im Darm vorhanden, und die Leber ist eine rosa oder orange Struktur, die über den goldbraunen Darm verteilt ist und mit CFP-Fluoreszenz deutlich visualisiert werden kann. Drücken Sie die feine Zette so zusammen, dass sich die Zinken berühren und schieben Sie die Zinken zwischen Leber und Darm. Dann trennen Sie langsam die Zinken, um die Pfortaderbefestigungen zwischen Leber und Darm zu brechen.
Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Portalverbindungen zwischen Leber und Darm durchtrennt sind, und ziehen Sie den Bauchlappen mit einer feinen Zette aus dem Darm. Schneiden Sie den Bauchlappen frei vom Rest der Leber. Die Untersuchung des Tieres mit CFK-Fluoreszenz zeigt, dass der Bauchlappen entfernt wurde.
Wenn Sie fertig sind, geben Sie den Fisch vorsichtig vom Schwamm in den Tank mit Systemwasser und strömen Sie das Systemwasser für einige Minuten über die Kiemen, bis sich der Fisch erholt und von selbst schwimmt. Nachdem Sie den Fisch eingeschläfert haben, entfernen Sie ihn aus dem Eiswasser. Legen Sie es in die Rille eines Schwamms mit der ventralen Seite nach oben und machen Sie einen Schnitt der ventralen Körperwand an der vorderen hinteren Position des Herzens.
Machen Sie dann zwei weitere Einschnitte von den Rändern des ersten Schnitts, die entlang der vorderen hinteren Achse zu den Beckenflossen verlaufen, und schälen Sie die Haut und den Muskel zurück, um die viszeralen Organe freizulegen. Die viszeralen Organe können nun sowohl mit Hellfeld- als auch mit Fluoreszenzmikroskopie visualisiert werden. Die Lebererholung nach partieller Hepatektomie wurde durch Berechnung des Leber-Körpergewichts-Verhältnisses geschätzt, das bei Männern 1,8% und bei Frauen 3,3% betrug.
Das Leber-Körpergewicht-Verhältnis beider Geschlechter wurde am Tag null nach der Operation und am siebten Tag bei partieller Hepatektomie und Scheinkontrollen bestimmt. Am Tag Null nach der Operation haben Scheintiere einen sichtbaren Ventrallappen, aber bei partiellen Hepatektomietieren fehlte der Ventrallappen vollständig, was zu einer 30% igen Verringerung bei Männern und einer 20% igen Verringerung bei Frauen des Lebergewichts führte. Am siebten Tag nach der Operation wurde bei partiellen Hepatektomietieren der Ventrallappen nicht regeneriert, und das Verhältnis von Leber zu Körpergewicht bei partieller Hepatektomie und Scheinkontrollen war vergleichbar, was auf eine wiedergewonnene Lebermasse nach partieller Hepatektomie hindeutet.
Der Einfluss der Zeit auf die Regeneration des Ventrallappens wurde durch eine vollständige 1/3 partielle Hepatektomie und die Messung des Ventrallappens zum Darmlängenverhältnis bestimmt. Der Ventrallappen nahm bei Scheinkontrollen 50 bis 100% der Darmlänge ein, war aber bei 1/3 partiellen Hepatektomietieren stark reduziert. Partielle Hepatektomie-Tiere am 36. Tag nach der Operation hatten ein erhöhtes Verhältnis von Ventrallappen zu Darm im Vergleich zum ersten Tag nach der Operation.
Eine statistisch signifikante vermehrte Größe des Ventrallappens wurde bei Tieren beobachtet, die sich am 36. Tag nach der Operation von einer partiellen Hepatektomie erholten, verglichen mit dem ersten Tag, jedoch nicht bei Scheinkontrollen. Einige Tiere regenerierten den Bauchlappen, andere jedoch nicht, was auf eine Variation der Operationsreaktion hindeutet. Der kritischste Teil dieses Protokolls besteht darin, Leber und Darm sauber zu trennen, damit der Bauchlappen vollständig entfernt werden kann.
Eine partielle Häpatektomie bei Zebrafischen kann in mutierten oder transgenen Linien durchgeführt werden, um die genetischen Anforderungen für die Leberregeneration zu bestimmen.
