Этот протокол позволит исследователям воспользоваться имеющимися химическими и генетическими инструментами для изучения механизмов регенерации печени у рыбок данио. Частичная гепатэктомия позволяет точно удалить ткань для стимуляции регенерации печени без необходимости воздействия токсического повреждения печени на все тело. Только понимая молекулярные и клеточные механизмы регенерации печени, мы можем разработать новые методы лечения пациентов с прогрессирующим заболеванием печени.
Для начала извлеките рыбу из аквариума Трикаина с помощью щипцов и вставьте их в канавку пропитанной трикайном губкой вентральной стороной вверх. Затем поместите губку под рассекающий микроскоп с нисходящей подсветкой. Защемите кожу и чешуйки чуть поздняя часть сердца тонкими щипцами и создайте отверстие в полости тела, сделав разрез под щипцами подпружиненными ножницами.
Поверните губку и сделайте трех-четырехмиллиметровый разрез вдоль брюшка, разрезая заднюю часть к брюшным плавникам. Затем поверните губку назад. Сожмите стороны губки одной рукой, чтобы вытеснить висцеральные органы из полости тела.
Вентральная доля печени присутствует в верхней части кишечника, а печень представляет собой розовую или оранжевую структуру, распределенную по золотисто-коричневой кишке, и может быть четко визуализирована с помощью флуоресценции CFP. Сожмите тонкие щипцы так, чтобы зубья касались друг друга и скользите зубьями между печенью и кишечником. Затем медленно отделите зубцы, чтобы разорвать прикрепления воротной вени между печенью и кишечником.
Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будут разорваны все портальные связи между печенью и кишечником, и вытяните вентральную мочку из кишечника с помощью тонких щипцов. Отрежьте вентральную мочку, свободную от остальной части печени. Обследование животного с флуоресценцией CFP показывает, что вентральная доля была удалена.
Когда закончите, осторожно перенесите рыбу из губки в резервуар, содержащий системную воду, и продуйте системную воду через жабры в течение нескольких минут, пока рыба не восстановится и не заплывет самостоятельно. После усыплении рыбу извлеките ее из ледяной воды. Поместите его в бороздку губки вентральной стороной вверх и сделайте разрез стенки вентрального тела в переднем заднем положении сердца.
Затем сделайте еще два разреза от краев первого разреза, которые проходят вдоль передней задней оси до брюшных плавников, и отшелушивайте кожу и мышцы, чтобы раскрыть висцеральные органы. Висцеральные органы теперь можно визуализировать как с помощью яркого поля, так и с помощью флуоресцентной микроскопии. Восстановление печени после частичной гепатэктомии оценивалось путем расчета соотношения печени к массе тела, которое составило 1,8% для мужчин и 3,3% для женщин.
Отношение печени к массе тела обоих полов определяли на нулевом дне после операции, а на седьмом дне при частичной гепатэктомии и фиктивном контроле. На нулевой день после операции фиктивные животные имеют видимую вентральную мочку, но у животных с частичной гепатэктомией вентральная доля полностью отсутствовала, что привело к снижению на 30% самцов и на 20% у самок соотношения печени к массе тела. На седьмой день после операции у животных с частичной гепатэктомией вентральная доля не была регенерирована, а соотношение печени к массе тела при частичной гепатэктомии и фиктивном контроле было сопоставимым, что указывает на восстановление массы печени после частичной гепатэктомии.
Влияние времени на регенерацию вентральной доли определяли путем выполнения полной 1/3 частичной гепатэктомии и измерения отношения вентральной доли к длине кишечника. Вентральная доля занимала от 50 до 100% длины кишечника в фиктивной контрольной части, но была сильно уменьшена у животных с частичной гепатэктомией. Животные с частичной гепатэктомией на 36-й день после операции имели повышенное соотношение вентральной доли к кишечнику по сравнению с послеоперационным днем первого.
Статистически значимое увеличение размера вентральной доли наблюдалось у животных, восстанавливающихся после частичной гепатэктомии на послеоперационный день 36 по сравнению с первой днем, но не в фиктивной контрольной группах. Некоторые животные регенерировали вентральную мяку, но некоторые нет, что указывает на изменение реакции на операцию. Наиболее важной частью этого протокола является чистое разделение печени и кишечника, чтобы вентральная доля могла быть полностью удалена.
Частичная гепатэктомия у рыбок данио может быть выполнена в мутантных или трансгенных линиях, чтобы оставить генетические потребности в регенерации печени.
