Este protocolo permitirá que os pesquisadores aproveitem as ferramentas químicas e genéticas disponíveis para estudar os mecanismos de regeneração hepática em zebrafish. A hepatectomia parcial permite a remoção precisa do tecido para estimular a regeneração hepática sem a necessidade dos efeitos em todo o corpo da lesão hepática tóxica. Somente entendendo os mecanismos moleculares e celulares da regeneração hepática podemos projetar novas terapias para tratar pacientes com doença hepática avançada.
Para começar, remova o peixe do tanque tricaine usando fórceps e incorpore-os no sulco de uma esponja encharcada de Tricaine com o lado ventral para cima. Em seguida, coloque a esponja sob um microscópio dissecando com iluminação de cima para baixo. Aperte a pele e escamas apenas posteriormente ao coração com fórceps finos e crie um buraco na cavidade corporal fazendo um corte sob os fórceps com a tesoura carregada de mola.
Gire a esponja e faça uma incisão de três a quatro milímetros ao longo do abdômen cortando posterialmente em direção às barbatanas pélvicas. Então gire a esponja de volta. Aperte os lados da esponja com uma mão para forçar os órgãos viscerais a saírem da cavidade corporal.
O lobo ventral do fígado está presente em cima do intestino, e o fígado é uma estrutura rosa ou laranja espalhada sobre o intestino marrom dourado, e pode ser claramente visualizada com fluorescência CFP. Aperte os fórceps finos para que as latas se toquem e deslizem as latas entre o fígado e o intestino. Em seguida, separe lentamente as latas para quebrar os laços da veia portal entre o fígado e o intestino.
Repita este processo até que todas as conexões do portal entre o fígado e o intestino tenham sido cortadas, e puxe o lobo ventral do intestino usando fórceps finos. Corte o lobo ventral livre do resto do fígado. O exame do animal com fluorescência cfp demonstra que o lobo ventral foi removido.
Quando terminar, transfira cuidadosamente o peixe da esponja para o tanque contendo água do sistema e flua a água do sistema sobre as brânquias por alguns minutos até que o peixe se recupere e nade por conta própria. Depois de eutanásia do peixe, remova-o da água gelada. Coloque-a no sulco de uma esponja com o lado ventral para cima e faça uma incisão da parede do corpo ventral na posição posterior anterior do coração.
Em seguida, faça mais duas incisões das bordas da primeira incisão que correm ao longo do eixo posterior anterior até as barbatanas pélvicas, e retire a pele e o músculo para revelar os órgãos viscerais. Os órgãos viscerais agora podem ser visualizados com microscopia de campo brilhante e fluorescência. A recuperação hepática após hepatectomia parcial foi estimada pelo cálculo da relação peso hepático/corporal, que foi de 1,8% para os homens e 3,3% para as mulheres.
A relação peso hepático/corporal de ambos os sexos foi determinada no dia zero pós-cirurgia, e no sétimo dia em hepatectomia parcial e controles falsos. No dia zero pós-cirurgia, os animais falsos têm um lobo ventral visível, mas em animais de hepatectomia parcial, o lobo ventral estava completamente ausente, o que resultou em uma redução de 30% no sexo masculino e redução de 20% nas proporções de peso hepático/corporal. No sétimo dia de cirurgia em animais de hepatectomia parcial, o lobo ventral não foi regenerado, e as relações hepáticos e de peso corporal em hepatectomia parcial e controles falsos foram comparáveis, indicando a recuperação da massa hepática após hepatectomia parcial.
O efeito do tempo na regeneração do lobo ventral foi determinado pela realização de uma hepatectomia parcial de 1/3 e medição do lobo ventral à razão do comprimento do intestino. O lobo ventral ocupou de 50 a 100% do comprimento do intestino em controles falsos, mas foi severamente reduzido em animais de hepatectomia parcial de 1/3. Os animais parciais de hepatectomia no dia 36 pós-cirurgia apresentaram maior relação ventral ao intestino em comparação com o primeiro dia pós-cirurgia.
Observou-se aumento estatisticamente significativo do lóbulo ventral em animais que se recuperam de hepatectomia parcial no dia 36 pós-cirurgia em comparação com o primeiro dia, mas não em controles falsos. Alguns animais regeneraram o lobo ventral, mas outros não, indicando variação na resposta à cirurgia. A parte mais crítica deste protocolo é separar o fígado e o intestino para que o lobo ventral possa ser totalmente removido.
Hepatectomia parcial em zebrafish pode ser realizada em linhas mutantes ou transgênicas para avaliar os requisitos genéticos para a regeneração hepática.
