Name: surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes
Uploaded: 2015-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
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This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.

NOTA: Algunos de los pasos del protocolo a continuación requieren trabajar en una campana de extracción limpia. Además, el método requiere un microscopio de disección tétrada levadura equipado con un objetivo 10X distancia larga de trabajo para supervisar formación de esferoplastos. El microscopio debe establecerse en la campana antes de tiempo. Retire el brazo micromanipulador y soporte de la placa del ámbito de aplicación y colocar estos elementos en un lugar seguro lejos de la zona de trabajo. 1. Preparación de esferoplastos <ol><li> Crecer levadura bajo las condiciones deseadas. Utilice aproximadamente 2 x 10 8 células para cada muestra, por ejemplo, 4 ml de un cultivo a DO600 = 1,4 5 x 10 7 células / ml. Aunque el procesamiento inmediato de las muestras puede ser preferible en algunos casos, para la mayoría de aplicaciones, alícuotas de células pueden ser almacenadas en hielo durante hasta 8 horas antes de ser procesados. </li><li> Transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugado en una centrifugadora clínica en la configuración 5 (2345 rpm / 857,5 xg) durante 3 min para sedimentar las células. </li&gt; <li> Decantar el medio toma cuidado de no perder las células del sedimento. Resuspender las células en tampón de ZK 1 ml y luego añadir 40 l 1 M ditiotreitol (DTT). Incubar 2 minutos con agitación suave. Células de pellets como antes (ver el paso 1.2). </li><li> Gránulos Resuspender en tampón de ZK 1 ml. Añadir 5 l de una solución recién preparada de 100T zimoliasa que se ha mezclado a fondo. Incubar durante 20 a 30 minutos a 30 ° C para eliminar la pared celular y producir esferoplastos. </li><li> Ensayar una gotita de 10 l de suspensión de células en un portaobjetos de microscopio para determinar si es completa formación de esferoplastos. Las células vistos bajo el microscopio de disección sin cubreobjetos. Las células deben aparecer hinchada y redonda en lugar de un poco oblonga y deben lisar tras la adición de 20 l de agua. Si las células no pueden lisar, devolver la muestra a 30 ° C y re-ensayo cada 10 min hasta que se observa fácilmente inducida agua de lisis. Células de pellets como antes (ver el paso 1.2). </li><li> Resuspender suavemente y lavar las células de pellets in 2,5 ml MES / tampón sorbitol frío. Células de pellets como antes (ver el paso 1.2). Resuspender suavemente el sedimento celular en 300-400 l MES frío / tampón sorbitol. Las células se pueden mantener en el hielo en esta etapa durante varias horas. </li></ol> 2. Difundir Cromosoma NOTA: Las superficies de vidrio sobre el cual los cromosomas se diapositivas o bien repartidas-cubreobjetos-debe estar preparado antes de tiempo. Cada portaobjetos o cubreobjetos deben ser sumergidos en agua, a continuación, EtOH, después se dejó secar, y se pule con papel para lentes. Si los cromosomas se repartirán en cubreobjetos, el cubreobjetos debe ser colocada en una diapositiva con cinta adhesiva o pegamento de caucho. A menos que se indique lo contrario, el resto del protocolo describirá la difusión ya sea en un portaobjetos o cubreobjetos <ol><li> Usando una pipeta P20, pipeta de 20 l de suspensión celular sobre la superficie de un portaobjetos limpio. </li><li> Utilizando una pipeta P200, añadir 40 l de la PFA / solución de sacarosa al 3% y mezclar suavemente el solution por &quot;remolinos&quot; la diapositiva con la mano hasta que las líneas Schlieren desaparecen. Coloque diapositiva bajo el microscopio y confirmar que las células están en foco. La solución PFA debe ser recién preparado en la campana de humos en el día de uso. NOTA: Si la proteína de interés no ha sido examinada por el método anteriormente, es aconsejable preparar diapositivas adicionales utilizando soluciones que contienen 2 y 4% PFA para determinar si la retención de la proteína es sensible a las condiciones de fijación. Una solución / sacarosa 4% PFA se utiliza en los casos en los que es deseable para visualizar los microtúbulos de tubulina asociados. La desventaja de la concentración fijador superior es que los cromosomas serán &quot;underspread,&quot; 2% PFA también tiende a producir cromosomas &quot;underspread&quot;. </li><li> Usando una pipeta P200, añadir 80 l de 1% Lipsol, girar como antes para mezclar soluciones tan completamente como sea posible, se inicia un temporizador. Si Lipsol no está disponible, 80 l 1% NP40 o 80 l dH 2 O, se puedensustituido (ver resultados representativos, Figura 2). </li><li> Ver las células con cuidado y suavemente girar la diapositiva cada 15 seg. Cuando más o menos 80% de las células se han lisado (desaparecido) detener el temporizador, retire inmediatamente el portaobjetos del microscopio, añadir 80 l de PFA / solución de sacarosa, y agitar para mezclar. Lisis debe ocurrir de entre 30 y 90 seg después de comenzar el temporizador. NOTA: Si varias diapositivas muestran lisis en aproximadamente el mismo tiempo, uno eventualmente puede omitir la supervisión microscópica para el resto de las diapositivas y simplemente el tiempo cuidadosamente el periodo entre la adición de lipsol y la adición de la alícuota final del fijador. Sin embargo, este atajo sólo es fiable cuando se preparan varias diapositivas de la misma muestra. Lo mejor es controlar la lisis de cada muestra microscópicamente cuando diferentes diapositivas se preparan a partir de muestras tomadas en diferentes épocas o de diferentes culturas. </li><li> Colocar el portaobjetos en una superficie plana y limpia y difundir el líquido a través de todo el surfac unfrostede de la corredera usando el lado de A, pipeta desechable limpio Pasto mantenido por debajo del menisco de la &quot;charco&quot;, pero por encima de la superficie de la misma diapositiva, es decir. no &quot;rastrillo&quot; la superficie de la corredera con la pipeta. No vuelva a utilizar la pipeta en diferentes diapositivas para evitar la contaminación de las muestras. </li><li> Deja las diapositivas que se seque durante la noche en la campana de humos. Componentes nucleares insolubles se depositan sobre la superficie de deslizamiento y se unen a ella. Para grandes experimentos, la planificación del uso del espacio para la etapa de secado es importante. </li><li> Una vez secos, los resultados óptimos se obtienen por progresar a la etapa de inmunotinción en el mismo día. Sin embargo, la solución de sacarosa se secó incrusta los cromosomas de propagación en un &quot;miel&quot; que permite la congelación de las muestras: las diapositivas pueden ser transferidos a una caja de portaobjetos de plástico y se almacenaron a -20 ° C durante años. </li></ol> 3. La inmunotinción <ol><li> Diapositivas Dip en 0,2% Foto-Flo para 30 seg. para eliminar la miel. Diapositivas de Lean enun borde, con el borde que descansa sobre una toalla de papel, para eliminar residuos Photo-Flo. </li><li> Diapositivas Dip en 1x TBS durante 5 min para lavar. Retire el exceso de líquido apoyándose diapositivas en un borde, pero no deje que se sequen. </li><li> Coloque las diapositivas helado hacia arriba, pipeta 300 l TBS / BSA sobre el portaobjetos través de la porción no glaseado de la diapositiva. </li><li> Incubar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 15 min. (Recipiente grande de plástico llena de agua saturada de toallas de papel debajo de una caja de diapositivas placa de metal o de plástico perforada con toallas de papel saturadas). </li><li> Escurrir diapositivas descansando un borde corto de la diapositiva en una toalla de papel y se inclina la diapositiva contra un soporte apropiado (como un bastidor de tubo de ensayo). No permita que la superficie se seque. </li><li> Inmediatamente aplique 80 l de tampón TBS / BSA que contiene la dilución apropiada de anticuerpo primario. Si el anticuerpo está limitando, utilice 40 ly un mm cubreobjetos de 22 x 22. Para suero de conejo crudo, esto es típicamente entre una dilución de 1/50 y 1/500. NOTA:Realizar las valoraciones para nuevos preparaciones de anticuerpos. Se elige la preparación más diluida que da la señal de alto por encima del fondo. Para controlar el nivel de la tinción de fondo, los núcleos deben prepararse a partir de la cepa mutante de deleción apropiado y / o diapositivas duplicados deben teñirse con suero pre-inmune. </li><li> Coloque una pulida 22 x 50 mm cubreobjetos sobre el portaobjetos evitando burbujas. Para ello, la celebración de la cubreobjetos entre el pulgar y el dedo índice a lo largo del borde largo en posiciones cerca de un borde corto. Sosteniendo el cubreobjetos en un ángulo de 30 ° con respecto al deslizamiento, la más alejada del borde corto de los dedos se baja hasta que descanse en la diapositiva justo dentro del borde de la &quot;charco&quot; más cercano a la región de esmerilado de la diapositiva. Entonces baje lentamente el cubreobjetos en un movimiento suave hasta que los dedos que sostienen el toque de diapositivas el banco, y luego suelte. No intente ajustar la posición del cubreobjetos vez aterriza. NOTA: Si extensiones de cromosomas se prepararon encubreobjetos adosadas (en lugar de directamente sobre la superficie de diapositivas), este cubreobjetos muestra permanecerá fijado a la corredera a través de los pasos de tinción y lavado. Un cubreobjetos adicional se colocará en la parte superior del cubreobjetos muestra para distribuir uniformemente la solución de anticuerpo durante la tinción y luego desechado. </li><li> Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda sellado e incubar durante la noche a 4 ° C. </li><li> La celebración de la transferencia de borde esmerilado las diapositivas a un estante de tinción de portaobjetos de vidrio y sumergirse en un frasco de tinción que contiene TBS. </li><li> Sumergir suavemente la diapositiva arriba y abajo para quitar el cubreobjetos. Trate de no usar demasiada fuerza para hacer esto. Lave las diapositivas 2x 10 min sumergiendo en TBS. Eliminar diapositivas de cremallera y drenar el exceso de líquido al tocar el borde de la toalla de papel. No deje secar la superficie. </li><li> Trabajando bajo la luz tenue, añadir inmediatamente 80 l TBS / BSA que contiene una dilución veces 1/1000 del anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo (o 40 l con un cubreobjetos de 22 x 22 mm). Una dd cubreobjetos como antes y se incuba a 4 ° C durante 2 horas en la cámara húmeda en la oscuridad. </li><li> Retire cubreobjetos como antes, drene diapositivas, y permitir que la superficie se seque al aire durante 1 a 2 horas en la oscuridad. Diapositivas de Lean sobre toallas de papel como antes. NOTA: Si la difusión se realizó en un cubreobjetos montados, separar el cubreobjetos de la corredera antes de secar. Los cubreobjetos se secan a continuación como se ha descrito para las diapositivas en el paso anterior. </li><li> Trabajando bajo la luz tenue, añadir unos 30 l de medio que contiene DAPI (10 gotas tres mu l) de montaje y luego baje cuidadosamente un cubreobjetos. Si los márgenes son en cubreobjetos, coloque las gotas de medio de montaje sobre un portaobjetos limpio y bajar el cubreobjetos, lado cromosoma abajo, sobre el portaobjetos. </li><li> Todavía bajo la luz tenue, espere 2 minutos para cubreobjetos para asentarse y sellar los bordes de cubreobjetos con esmalte de uñas transparente. Coloque las diapositivas en una caja de compuerta plana. NOTA: Para microscopía STED, monte con prolongar Gold. Utilice 30 l de prolongar Orosin DAPI y deje curar durante la noche. Sellado con esmalte de uñas es innecesario. </li><li> Ver diapositivas mediante microscopía de epifluorescencia de campo amplio con un 40 u objetivo 100X utilizando un conjunto de filtros apropiados para DAPI para enfocar. Opcionalmente almacenar el portaobjetos en la oscuridad a 4 ° C durante varias semanas. No lo congele. </li></ol>

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	<li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast.">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li><li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast.">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li><li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes.">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li><li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis.">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li><li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+identifies+Monopolin:+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I.">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li><li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+RecA-like+recombinases:+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis.">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li><li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1/Aurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint.">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li><li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast.">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li><li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation.">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li><li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+:+a+publication+of+the.">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalized for each spheroplast sample by direct observation of lysis with a light microscope. To the trained eye, round spheroplasts darken as they swell before lysis; after lysis cellular remnants appear as floating &#8220;ghosts&#8221;. The combination of experimentally optimized reagent concentrations, and inter-sample standardization of timing, yields consistently well-spread nuclei. 
The choice of fluorophore and microscope used to visualize spread chromosomes depends on the desired structure. In general, spread nuclei are very thin (about 200 nm or less) and soluble protein is removed by the procedure. Thus, the reduction of out-of-focus fluorescence provided by confocal or total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy yields little benefit. In fact, if manual focusing reveals staining in multiple focal planes, the nucleus is likely underspread. Although any fluorophore compatible with the microscope can be used for staining, shorter wavelength fluors will improve spatial resolution. For example, spatial resolution progressively decreases as the same structure is stained with a green (Alexa 488), red (Alexa 594), far-red (Alexa 647), or infrared (Alexa 750) fluor. This relationship should be considered in the planning and interpretation of experiments. If an even greater level of structural detail is desired, a super-resolution microscope is required. The details of the staining procedure required for each of these applications differ from those described above and the appropriate staining protocol should be followed9. 
Finally, although direct spreading of nuclei on microscope slides is relatively easy, spreading on slide-mounted coverslips yields significantly improved resolution as it avoids viewing the chromosomes through a layer of mounting medium that contains a high concentration of glycerol. Mounting coverslips on slides requires more dexterity and patience than spreading on slides, but this extra effort can be worthwhile depending on the type of structures being analyzed.

La incipiente levadura Saccharomyces cerevisiae ofrece muchas ventajas para el estudio de los mecanismos moleculares de los procesos biológicos, incluyendo el estudio de las proteínas que controlan la función cromosoma. Aunque hay ventajas bien conocidas de la levadura en ciernes para estudios genéticos, moleculares, y bioquímicos, los estudios citológicos de la distribución de las proteínas en el núcleo de la célula se complica por su pequeño tamaño. El núcleo típico de levadura tiene un diámetro de menos de una micra, que está a sólo unos 5 veces el límite de resolución de la luz visible. Por lo tanto, la cantidad de información acerca de la distribución de las proteínas nucleares que se puede obtener a partir de la inmunotinción convencional o mediante el uso de etiquetas de proteínas fluorescentes, tales como la proteína fluorescente verde (GFP), es limitado. Un enfoque útil para caracterizar la distribución de las proteínas es subnuclear superficie cromosoma propagación. Este enfoque implica la eliminación de la pared celular, lo que altera las células y membranas nucleares, y unllowing los contenidos insolubles del núcleo se asienten sobre la superficie de un portaobjetos de microscopio. Estos componentes insolubles incluyen la matriz nuclear y los cromosomas. Además de permitir la eliminación de los contenidos nucleares solubles, lo que mejora la capacidad de detectar las proteínas unidas de la cromatina, el cromosoma propagación método da como resultado la descompresión sustancial de los cromosomas de tal manera que los núcleos de propagación tienen diámetros de alrededor de 3 a 5 micras (para núcleos diploides meióticas) y de 2 a 3 micras para núcleos mitóticos diploides. Esta descompresión permite la detección de la subestructura nuclear que es relativamente difícil o imposible de resolver en los núcleos intactos. Un inconveniente obvio para el cromosoma de ensanchamiento es la posibilidad de que el procedimiento de difusión puede interrumpir parcial o totalmente la estructura de interés. De particular preocupación es que una proteína unida cromosoma particular, podría perderse como consecuencia del procedimiento de difusión. Este potencial shou complicaciónld tenerse en cuenta al interpretar los datos. Un ejemplo de una proteína que es sensible a la propagación de procedimiento es beta-tubulina. Bajo algunas condiciones, el husillo, que se compone principalmente de la tubulina, se conserva durante la extensión 3. Visualización del husillo es a menudo útil para organizar los núcleos de interés. Sin embargo, la visualización de la tubulina requiere tratamiento con un fijador alta concentración; husillos se pierden en las condiciones estándar descritas a continuación. Este ejemplo ilustra que, al analizar la distribución de una proteína no caracterizado previamente, es importante para variar la concentración de fijador para determinar la sensibilidad de la proteína es a tal variación. A pesar de la preocupación por el impacto de las condiciones de propagación en la estructura cromosómica, la utilidad y el poder del método de propagación se ha demostrado en muchos contextos y tiene amplia utilidad en la caracterización de mitótico y, especialmente células meióticas 4-7. Two métodos de propagación se han utilizado ampliamente. El primero de estos métodos, desarrollados por Dresser and Giroux 8, evita el uso de detergente y puede producir preparaciones separadas que parecen tener relativamente bien conservado morfología cromosómica cuando se tiñen para el ADN específico de tinte DAPI. Sin embargo, este método es relativamente difícil de perfeccionar y la calidad de los núcleos de propagación varía dramáticamente, cuando una región de una diapositiva se compara con otras regiones. Este problema se puede complicar enfoques cuantitativos que implican la formación de imágenes muchos núcleos no seleccionadas de una diapositiva para evitar el sesgo de datos de adquisición. El segundo cromosoma método de propagación, desarrollado por Loidl y Klein 1, consiste en equilibrar la fijación de paraformaldehído, con la lisis y descompresión cromatina promovido por una solución de detergente. Cuando se realiza correctamente, este método da resultados muy reproducibles con menos variación de región a región en comparación con el método de Dresser y Giroux. Esta presentación se centra en un modified versión del método de Loidl y Klein, debido a su fiabilidad y la sencillez. Cromosoma propagación no es complicado ni requiere mucho tiempo; hasta 100 diapositivas se pueden preparar para inmunotinción en un solo día. Además, las preparaciones de cálculo se pueden almacenar en el congelador durante años antes de la inmunotinción, y por lo tanto los laboratorios pueden desarrollar un repositorio de extensiones de cromosomas congelados que se puede utilizar cuando surgen nuevas cuestiones biológicas o nuevos reactivos de tinción estén disponibles. El método de propagación de cromosoma se usa más comúnmente en combinación con inmunotinción y microscopía de fluorescencia de campo amplio, pero también es posible preparar diapositivas para super-resolución métodos microscópicos de luz tales como el agotamiento de la emisión estimulada (STED) microscopía.

<table><tbody><tr><td>Zymolyase</td><td>US Biological&amp;nbsp;</td><td>Z1004</td><td>Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4&amp;deg;C until ready for use.</td></tr><tr><td>Lipsol&amp;nbsp;</td><td>L.I.P. Ltd&amp;nbsp;</td><td>no longer commercially available</td><td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>USB</td><td>19628</td><td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Standard coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-544-E or 12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>High resolution coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 solution</td><td>Kodak</td><td>P-7417</td><td>Prepare 0.2% (v/v) solution in water.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4&amp;deg;C for up to a month.</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>IgG (H+L) Antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting media with DAPI</td><td>Vector&lt;br/&gt; Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Plastic slide box</td><td>Fisher</td><td>03-448-1</td><td>Store slides containing dried spreads in slots at -20&amp;deg;C. Also, use as a wet chamber.</td></tr><tr><td>Cardboard slide box</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Fisher</td><td>08-816</td><td>Use as a wash basin for slides.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

La aparición de núcleos de propagación depende críticamente sobre el equilibrio entre el cromosoma fijación y de-compactación. Incluso cuando los reactivos se equilibran correctamente, la variación en el grado de cromosoma de-compactación puede ocurrir en diferentes regiones de la misma diapositiva y / o entre diferentes diapositivas. Por lo tanto, la calidad de los diferenciales en una región determinada de una diapositiva debe evaluarse antes se interpretan las imágenes. Los efectos de la &quot;muchedumbre&quot; y &quot;underspreading&quot; pueden ilustrarse utilizando anticuerpos contra las proteínas de recombinación meiótica. En la Figura 1, los núcleos son meióticas doble inmunotinción para las dos proteínas de la línea de cambio eucariotas Rad51 y Dmc1 y contador teñidas con DAPI para el ADN. Dos ejemplos de núcleos de manera óptima repartidos se muestran en la Figura 1A. La Figura 1B muestra un ejemplo de un núcleo underspread y ejemplos Figura 1C de dos núcleos overspread. Notaque un menor número de focos Rad51 y Dmc1 se observan en ambos una y underspread núcleos en comparación a difundir adecuadamente los núcleos. En el caso de núcleos underspread, algunos focos están fuera de foco debido a que la muestra no es suficientemente plana. Además, la accesibilidad epítopo puede contribuir a la falta de detección de todos los focos. Además, el diámetro más pequeño de la propagación puede impedir la resolución de las estructuras estrechamente espaciados. En el caso de núcleos overspread, la proteína se puede perder debido a la fijación insuficiente y / o tratamiento con detergente excesiva. Variaciones del método estándar pueden evitar el uso de Lipsol. La versión original del método de propagación descrito por Loidl et al. hace uso de Lipsol, un laboratorio decoro cristalería detergente 1. Aunque este detergente se utiliza actualmente para el cromosoma difusión en muchos laboratorios, la formulación original ya no está disponible en el mercado y el producto se vende actualmente bajo ese nombre ha sido re-formulado. Furthermore, la fórmula original para Lipsol también no está disponible (Franz Klein, comunicación personal). En un esfuerzo por superar este problema, llevamos a cabo experimentos en los que se utilizó el NP40 detergente disponible en el mercado y definido químicamente en lugar de Lipsol; Se encontraron esta modificación del protocolo estándar para dar resultados satisfactorios para un experimento en el que se extienden los núcleos meióticas se tiñeron para Rad51 y Zip1, un componente de la región central del complejo sinaptonémico (Figura 2). Curiosamente, en sustitución de la solución Lipsol con el mismo volumen de dH 2 0 también dado resultados satisfactorios (Figura 2B). Aunque estos resultados indican que el método de difusión descrito anteriormente se puede emplear con éxito sin Lipsol, es posible que algunos resultados descritos anteriormente dependen de uso de Lipsol y no serán reproducibles si NP40 o H 2 0 se utiliza en su lugar. Un individuo aprender el método de propagación millasluchar elegir razonablemente comenzar utilizando NP40 y / o H 2 O en lugar de Lipsol. En el caso de que se encuentran dificultades, el investigador podrá solicitar una alícuota de Lipsol de un laboratorio que obtuvo un arsenal del reactivo antes de que se suspendió; Lipsol era barato y el importe mínimo se podía pedir era suficiente para generar millones de diapositivas. El método de propagación es adecuado para su uso con los métodos de microscopía de luz super-resolución. El complejo sinaptonémico consta de dos elementos laterales axiales / lineales cada uno de los cuales organiza un par de cromátidas hermanas en un conjunto de matrices de bucle, con la base de cada bucle unido a un elemento. Cromosomas Paquiteno han synapsed pares de elementos laterales mantenidos en paralelo a una distancia de 100 nm por las proteínas que forman la región central de la compleja synaptonemal. Estos elementos laterales pareados no pueden resolverse mediante microscopía de epifluorescencia widefield convencional, pero pueden ser resueltos por super-resolumétodos de. En la Figura 3, se muestra un núcleo pachytene que se tiñe con el mismo anticuerpo para la proteína Zip1, utilizado para el experimento en la figura 2. La muestra también se tiñó para la proteína Red1, un componente de elementos laterales axiales /. El resultado revela que el anticuerpo Zip1 reconoce la región de unión al elemento lateral de Zip1, en lugar de la alfa helicoidal alargada espiral de la bobina de dominio que se encuentra entre las regiones de unión de los elementos laterales. Por lo tanto, el patrón de tinción observado con este anticuerpo Zip1 revela los caminos paralelos de los elementos laterales pareadas. La distribución de Red1 focos a lo largo de los elementos laterales es relativamente escaso en comparación con Zip1 focos, pero el método de doble tinción muestra que Red1 focos generalmente se encuentran cerca de las trayectorias lineales definidas por Zip1 focos. Estos hallazgos son consistentes con el trabajo previo en el que se utilizó el mismo método de difusión para preparar muestras para el análisis por microscopía electrónica; la estructura tripartita del borrador sinaptonémicolex se conserva durante el procedimiento de difusión. La imagen mostrada en la Figura 3 se generó por microscopía STED 9. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53081/53081fig1.jpg" /> Figura 1: Ejemplos de núcleos propagación de núcleos teñidos para meióticos Dmc1 (verde), Rad51 (rojo), y el ADN (DAPI, azul).. Bar = 1 m. (A) 2 ejemplos de núcleos de manera óptima repartidas. (B) Un ejemplo de un núcleo underspread. (C) Dos ejemplos de núcleos cubrió. El ejemplo de la izquierda es un núcleo en el que se cubrió sólo la parte superior. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53081/53081fig2.jpg" /> Figura 2: meióticos núcleos preparados sin el uso de Lipsol Spread núcleos meióticas de las etapas indicadas tiñeron para Rad51 (rojo),.Zip1 (verde), y el ADN (DAPI, azul). Tenga en cuenta que la compactación cromosoma que se produce como células transición de leptonema a paquinema se conserva en gran parte. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53081/53081fig3.jpg" /> Figura 3: Visualización de la compleja synaptonemal a través de microscopía STED Un núcleo pachytene manchado para Zip1 (verde) y Red1 (rojo).. Los datos fueron procesados ​​utilizando el plugin DeconvolutionLab ImageJ 10 para ejecutar 100 iteraciones utilizando el modelo de Richardson-Lucy con un PSF STED medido.

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Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Difusión de superficies y inmunotinción de cromosomas de la levadura

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.9K vistas.  University of Chicago. A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

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Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Preparación de las propagaciones del cromosoma meiótico a partir de espermacitos de peces cebra

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Investigación

Genética

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Análisis de la elaboración de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la levadura en ciernes

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Biología

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

Bioquímica

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

Colonia de levaduras Método de anidamiento

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Visualización de Candida albicans en el tracto gastrointestinal murino utilizando hibridación fluorescente in situ

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Inmunología e Infección

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopía de la levadura de fisión del ciclo de vida sexual

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

Uso de microscopía de lapso de tiempo y agotamiento nuclear de proteínas en etapa específica para estudiar la meiosis en S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...