Este protocolo es importante ya que permite la investigación del sistema glinfático en un mamífero grande, lo que nos acerca a la comprensión del sistema glinfático en humanos. Hay dos ventajas en esta técnica. La introducción de rastros en la cisterna magna evita cualquier daño directo al cerebro, lo que contrasta con las inyecciones intraventriculares.
En segundo lugar, se trata de un enfoque directo que permite la visualización inmediata de la canulación y saber si ha tenido éxito o no. Comience colocando al cerdo en una posición prona. Palpar la parte posterior de la cabeza y el cuello para localizar y marcar la cresta occipital, la columna vertebral de las primeras vértebras torácicas y la base de cada oreja.
Dibuja una línea recta entre la cresta y las vértebras a lo largo del eje longitudinal. Luego, siguiendo la base del cráneo, dibuje dos líneas desde la cresta hasta la base de cada oreja. Sujete con cuidado la cola del animal y observe si hay un reflejo para ver si está en un sueño profundo.
Comience haciendo una incisión dérmica a lo largo de la línea longitudinal hasta el músculo usando un bisturí con una cuchilla número 21, luego extienda dos incisiones perpendiculares a lo largo de los hombros, cada una de 10 a 15 centímetros de longitud. A partir de la cresta occipital, haga incisiones dérmicas a lo largo de la línea hasta la base de cada oreja. Use fórceps anatómicos para agarrar las esquinas de la piel formadas en la cresta occipital, luego pase la hoja del bisturí ligeramente sobre la fascia para separar la piel del músculo subyacente.
Reseque la piel a lo largo de cada una de las cinco incisiones para visualizar partes del músculo trapecio. Use el bisturí para hacer una incisión longitudinal de aproximadamente un centímetro de profundidad donde el trapecio se une en la línea media, luego realice una disección contundente a lo largo del corte longitudinal en los músculos utilizando una combinación de pinzas quirúrgicas rectas y curvas, que separarán los vientres del trapecio y el músculo semiespinal de capitis bíter subyacente. Corte cualquier fibra muscular persistente con un bisturí y continúe realizando una disección contundente hasta que el complejo de capitis semiespinal se haga visible.
Muévete a lo largo de la cara posterior del cráneo y corta los orígenes de los músculos trapecio y semiespinalis capitis biventer. Para separar los dos músculos longitudinalmente, use las pinzas quirúrgicas para realizar una disección roma hasta que el complejo de capitis semiespinal sea completamente visible. Luego use los retractores autocontenedores para retraer los músculos trapecio y semiespinalis capitis biventer.
Use el bisturí para hacer una incisión longitudinal de un centímetro de profundidad donde los vientres del semiespinalis capitis complexus se unen en la línea media. Realice una disección contundente utilizando pinzas quirúrgicas trabajando a lo largo del corte longitudinal entre los vientres musculares hasta que tanto el atlas como el eje sean palpables. Muévase a lo largo de la cara posterior del cráneo, cortando los orígenes de los músculos semiespinales de la capitis compleja.
Use el bisturí y la disección roma para separar el músculo longitudinalmente de las vértebras subyacentes, luego use otro conjunto de retractores autocontenedores para retraer los músculos semiespinalis capitis complexus. Use un bisturí para eliminar cuidadosamente cualquier tejido restante que cubra la región donde el atlas se encuentra con la base del cráneo. Coloque un brazo sobre el cuello del animal y un dedo en la unión del atlas y el cráneo, luego eleve simultáneamente la cabeza y flexione el cuello mientras palpa con el dedo para revelar la cisterna magna.
Asegúrese de que una persona eleve y flexione la cabeza y el cuello del animal mientras que la otra palpa para la cisterna magna, tomando nota de su ubicación anatómica. Introduzca una cánula de calibre 22 lenta y cuidadosamente en la cisterna magna a través de la duramadre en un ángulo oblicuo al eje longitudinal, luego retraiga la aguja de la cánula y coloque una tapa en la cerradura. Comience con la aplicación de súper pegamento y un acelerador donde la cánula ingresa al tejido, luego aplique el cemento dental.
Espere cinco minutos para que el cemento se endurezca. Retire la tapa con cuidado de la cánula. Conecte la cánula al extremo masculino del grifo de la línea IV con el trazador utilizando una extensión de 10 centímetros.
Inyecte el trazador lentamente a una velocidad de 100 microlitros por minuto, ya sea a mano o utilizando una bomba de micro infusión. Retire el grifo de la línea IV y reemplácelo con la tapa. Compruebe si el trazador es visible pulsando en la base de la cánula.
Luego coloque sacos de arena debajo del cuello del animal para mantener cierta flexión. Suelte la cabeza y deje al animal en una posición prona en reposo. Suelte los retractores autocontenetivos y reemplace los músculos.
Use las pinzas de toalla quirúrgicas para unir la piel sobre los músculos. Primero use una gasa y luego una manta para cubrir las abrazaderas de la toalla y la incisión para limitar la pérdida de calor. Permita que el trazador circule durante el tiempo deseado.
Las imágenes macroscópicas cosidas de la superficie dorsal del cerebro pueden proporcionar información detallada sobre los patrones de distribución del trazador a través de los surcos y fisuras. Imágenes similares de las superficies ventral y lateral del cerebro pueden proporcionar información sobre la distribución del trazador en el lóbulo temporal y la fisura lateral. Las imágenes de la superficie cerebral de mayor aumento producidas con un estereoscopio pueden ayudar a visualizar el marcador en el PVS a lo largo de las arterias.
Las secciones macroscópicas del cerebro coronal proporcionan información sobre la profundidad de la penetración del trazador en la fisura interhemisférica y la distribución y estructura del trazador subcortical, como el hipocampo y el cuerpo estriado. La tinción inmunohistoquímica para AQP4, la proteína ácida fibrilar glial y la actina del músculo liso mostraron que el marcador se localizó dentro del PVS, así como se trasladó al parénquima cerebral. Los procesos del pie de astrocito que forman la superficie externa del PVS se identifican utilizando AQP4 y tinción de proteína ácida fibrilar glial.
Las células endoteliales que forman la superficie interna del PVS se tiñen con lectina y tinción GLUT-1. La tinción de AME identifica arterias y arteriolas y se puede usar para mostrar que la afluencia de PVS ocurre a lo largo de las arterias en lugar de las venas, lo que constituye la fisiología básica de la función glinfática normal. En el futuro, esperamos explorar el sistema glinfático a alta resolución en grandes mamíferos en el contexto de la neuropatología como el accidente cerebrovascular y la lesión cerebral traumática.
