Este protocolo ayuda a cultivar macrófagos derivados de la médula ósea de ratones deficientes en iNOS o BH4 utilizando medios y sueros cuidadosamente definidos con bajos niveles de BH4 y nitrato para evitar interferencias con los mecanismos redox. Al controlar cuidadosamente los niveles de contaminantes potenciales en el proceso de cultivo, podemos limitar la interferencia de óxido nítrico, asegurando la precisión y reproducibilidad del sistema modelo. Este método permite mediciones precisas de biopterinas, óxido nítrico y cualquier factor posterior relacionado con estos compuestos esenciales.
Demostrando el procedimiento estará el Dr. Thomas Nichol, un investigador postdoctoral de nuestro laboratorio. Para comenzar, coloque las patas en etanol al 70% durante dos minutos para lavar cualquier pelaje o residuo. Luego, transfiera las piernas a una placa de Petri bacteriológica limpia y estéril.
Raspe cuidadosamente a lo largo de la longitud de los huesos con la cuchilla, cortando los tendones y eliminando el músculo del hueso. Una vez que los huesos han sido eliminados del músculo, corte a través de la epífisis en la parte superior de la tibia, justo debajo de la rodilla. La tibia se puede cortar en el extremo inferior, justo por encima de la intersección con el peroné.
Finalmente, corte a través de la epífisis en cada extremo del fémur, justo antes de las articulaciones de la rodilla y la cadera. Para enjuagar la médula ósea, llene una jeringa de 10 mililitros con 10 mililitros de PBS y conéctela a una aguja. Luego inserte la aguja en la cavidad medular del hueso.
Enjuague suavemente con uno o dos mililitros de PBS, pasando la aguja hacia arriba y hacia abajo. Luego, extraiga la suspensión de cinco a diez veces dentro y fuera de una jeringa de un mililitro para desagregar. Recoja la suspensión en una jeringa de un mililitro y pásela a través de un colador de células de 70 micrómetros en un tubo de centrífuga limpio de 50 mililitros.
Finalmente, coloque las muestras sobre hielo. Para congelar la médula ósea para su uso posterior, centrífuga las células a 1000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet rojo en dos mililitros de anticongelante.
Luego, incubarlo a 80 grados centígrados durante la noche. Si se congela, descongele la suspensión rápidamente a 37 grados centígrados. Transfiera la suspensión celular a un tubo estéril limpio que contenga tres mililitros de medios DMEM/F-12.
A continuación, peletizar las células por centrifugación. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en tres mililitros del medio DMEM/F-12 preparado. Cuente las células y enchapándolas en artículos de plástico no recubiertos de TC en el medio preparado DMEM / F-12.
A continuación, incuba las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. En el quinto día, alimente las células agregando el 50% del volumen original de medios DMEM / F-12. En el sexto día, estimule las células agregando GM-CSF preparado a una concentración final de 50 nanogramos por microlitro directamente al medio de cultivo celular.
En el séptimo día, retire todos los medios de las células. Luego, lave las células brevemente con PBS precalentado y agregue medios DMEM / F-12 que contengan 2% de endotoxina baja FBS, 1X penicilina o estreptomicina, L-glutamina, 25 nanogramos por microlitro M-CSF y 50 nanogramos por microlitro GM-CSF. Finalmente, incubar las células durante la noche en medios para activar los macrófagos al fenotipo M0.
Para el fenotipo M1, estimular las células con 100 nanogramos por microlitro LPS, y 10 nanogramos por microlitro IFN-gamma. Para el fenotipo M2, estimular las células con 100 nanogramos por microlitro IL-4. Incubar las células durante la noche.
En el octavo día, las células están listas para la cosecha o el procesamiento posterior de acuerdo con las necesidades del investigador. Los medios suplementados con 10% fbS tenían nitrito y tetrahidrobiopterina similares, independientemente de M-CSF y GM-CSF, o LCM. Pero los niveles totales de biopterina fueron más altos en los medios suplementados con LCM.
Sin embargo, se observó más variabilidad entre los diferentes lotes de LCM. La PCR mostró un producto de par de bases 1030 en ratones de tipo salvaje, mientras que los ratones knockout GCH produjeron un producto de par base 1392, confirmando la escisión de los exones críticos. El tratamiento con tamoxifeno abolió la proteína GCH en las células knockout.
Las células knockout y de control todavía producían iNOS, después de la estimulación de LPS e IFN. Los BMDM cultivados a partir de ratones knockout GCH condicionales exhibieron una disminución significativa de la tetrahidrobiopterina y una disminución del nitrito. Las mismas células cultivadas en medios LCM no tenían expresión de GCH1.
Sin embargo, las células producen cantidades significativas de tetrahidrobiopterina y nitrito después de la eliminación. En el octavo día, no hubo diferencias significativas en la morfología entre el control no activado y los BMDM knockout de GCH a diferentes concentraciones de tamoxifeno. Los BMDM muestran las características esperadas de los macrófagos no estimulados, con células adherentes redondas y extremidades alargadas.
Cuando se trabaja con células primarias como esta, es imperativo esterilizar todos los tejidos y equipos a fondo. Además, elegir el medio y el suplemento adecuados es importante para mantener un ambiente bajo en óxido nítrico y BH4. Los gránulos y medios celulares se pueden utilizar para diversas aplicaciones posteriores, con un enfoque en el papel del óxido nítrico, la biopterina o el estado redox celular.
Puede incluir HPLC, qPCR y Western blot, entre otros.
