Este protocolo es una amalgama de varias técnicas que permitirían a los investigadores delinear el papel del gen candidato en la biología de los melanocitos. Es un enfoque holístico para lograr una inferencia lógica. Al combinar varios métodos, se pueden evitar los factores de confusión y puede ayudar a los investigadores a obtener un resultado sustancial.
Para comenzar el análisis, inmovilizar los 48 embriones HPF con 0,016% de tricaína. Monte los embriones usando unos pocos mililitros de 1.5 a 2% de metilcelulosa en una placa de Petri. Elija los embriones con una pipeta Pasteur y colóquelos en metilcelulosa para restringir el movimiento durante la obtención de imágenes.
Para obtener imágenes laterales o dorsales óptimas, ajuste su posición con un aumento de más de 5X. Coloque la placa de Petri bajo el microscopio. Usando un manipulador, ajuste el pez para que las cinco rayas embrionarias de melanocitos sean visibles al mismo tiempo.
Usando el software de adquisición, capture las imágenes. Si el pez se despierta, colóquelo en agua tricaine hasta que se estabilice. Usando la herramienta abierta en el software ImageJ, abra la imagen que se va a cuantificar.
Seleccione la herramienta de forma a mano alzada para delinear el área para el análisis. Seleccione la opción establecer medidas, haga clic en el valor gris medio y luego en el área. Para calcular el valor gris medio para el área seleccionada, haga clic en M o vaya a analizar y seleccione la medida.
Según la etapa de interés, transfiera los embriones a una placa de Petri que contenga 0,6 miligramos por mililitro de Pronasa. Usando una pipeta Pasteur, transfiera los embriones descorionados a una placa de Petri que contenga agua embrionaria simple después de cinco a 10 minutos. Con una pipeta de vidrio Pasteur, recolecte y transfiera alrededor de 100 embriones a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.
Deseche el medio y agregue 200 microlitros de solución de Ringers desyolking helada. Coloque el tubo sobre hielo y mezcle el contenido unas 20 veces con una pipeta para disolver el yugo. Centrifugar los tubos a 100 G durante un minuto a cuatro grados centígrados dos veces, y desechar el sobrenadante.
Transfiera los embriones desyemas utilizando una pipeta de un mililitro en una placa de Petri que contenga 10 mililitros de solución de tripsina. Mezclar la solución una o dos veces con una pipeta de un mililitro para disminuir la agregación. Pase la suspensión tripsinizada a través de un colador de 70 micrómetros colocado en un tubo cónico de 50 mililitros para recoger una suspensión de una sola celda.
Lave las placas de Petri con la suspensión tripsinizada para eliminar las células adheridas de la superficie. Para contar las células marcadas con fluorescencia usando un citómetro de flujo, después de crear una nueva carpeta de experimentos, dibuje un gráfico de dispersión hacia adelante versus hacia el lado. Haga un histograma para la intensidad del isotiocianato de fluoresceína.
Cargue primero las celdas de tipo comodín para establecer las puertas de dispersión delantera y lateral y el umbral FIFC. Después, cargue las células aisladas de embriones transgénicos de línea FTYRP GFP para contar los melanocitos. Monte los embriones en 1,5 a 2% de metilcelulosa en una placa de Petri.
Colóquelo bajo el microscopio y ajústelo en la orientación deseada con una punta de pipeta. Usando el software de adquisición, adquiera las imágenes. Para embriones de menos de 24 HPF, utilizando un aumento de 10X, captura la imagen completa, mientras que para embriones de más de 24 HPF, adquieren múltiples campos de escaneo y posteriormente los ensamblan.
Después de realizar el ensayo, la imagen de Brightfield después de 48 horas reveló la presencia de las cinco rayas de melanóforos pigmentados. En la etapa 48 HPF, se calculó el número de melanóforos laterales y se encontró que los morfantes h2afv de la variante histona demostraron un número reducido de melanóforos en comparación con el control. El valor gris medio se midió para los morfantes CA14 y h2afv, lo que reveló que los valores fueron más altos para las variantes que para los morfantes control.
Mediante el empleo de un método de absorción espectrofotométrica basado en hidróxido de sodio, se cuantificó el contenido de melanina donde los morfantes CA14 mostraron menos contenido que los morfantes control. Se realizaron imágenes de fluorescencia para evaluar la alteración basada en morfolino para diferentes etapas del desarrollo del melanóforo del pez cebra. El número de melanóforos en los morfantes CA14 y h2afv se analizó mediante FACS.
Se observó que el número de melanóforos en CA14 se mantuvo sin cambios, mientras que se redujeron significativamente en h2afv en comparación con el morfante control. También se calculó la intensidad media de fluorescencia por área, demostrando que los morfantes h2afv muestran una disminución considerable en el valor relativo a los morfantes control. Mientras ajusta el pez antes de la imagen, asegúrese de poder visualizar las cinco rayas de melanóforo.
Necesitas inclinar un poco el pez para distinguir entre las dos rayas laterales. Después de establecer el papel de un gen candidato en el desarrollo de melanocitos, podemos eliminar el gen de una manera específica del tejido utilizando la tecnología CRISPR. Ese será un enfoque más específico.
