Nuestro protocolo se puede utilizar para investigar la motilidad y localización de orgánulos astrocíticos o proteínas bajo ambientes extracelulares controlados y estados de enfermedad leves. A diferencia de las preparaciones fijas MHA, que proporcionan instantáneas individuales de localización de proteínas y orgánulos, nuestra técnica de imágenes en vivo se puede utilizar para analizar la dinámica de partículas en astrocitos vivos individuales. El día antes de la transfección se astrocita a la densidad adecuada para la toma de imágenes a las 24 a 48 horas después de la transfección.
Diluir el reactivo de lipofección en un medio sérico reducido a la concentración experimental adecuada. Diluir cinco microgramos de ADN de alta pureza en 250 microlitros de medio sérico reducido y añadir cinco microlitros de reactivo potenciador de lipofección al tubo. Mezclar el reactivo de lipofección con un volumen igual de la mezcla del potenciador de lipofción de ADN e incubar la solución durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, retire el sobrenadante del cultivo de astrocitos y agregue 100 microlitros de la mezcla de transfección a las células. Después de seis horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, reemplace el complejo de transfección por un volumen adecuado de medio de cultivo de astrocitos y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante 24 a 72 horas adicionales. 30 minutos antes de la toma de imágenes, diluir una sonda de etiquetado lisosomal adecuada en 200 microlitros de astrocitos medios a una concentración de trabajo de un micromolar y etiquetar los astrocitos con una sonda durante 30 minutos a 37 grados celsius.
Luego lave las células una vez con un medio de cultivo de astrocitos calientes y reemplace el lavado con un medio de imagen. Inmediatamente después del etiquetado de la sonda, coloque el recipiente de cultivo de astrocitos en el adaptador apropiado en la etapa del microscopio y utilizando la luz de fluorescencia EBI, localice las células que expresan proteínas fluorescentes o sonda. Utilice la cámara digital para ajustar la iluminación de la muestra fluorescente para visualizar las celdas seleccionadas y ajustar el enfoque y acercar a una sola celda.
A continuación, utilice las funciones Zoom y Enfoque definido para adquirir una sola serie de lapso de tiempo de pila Z a una frecuencia de un fotograma cada dos segundos para intervalos de tiempo que oscilan entre 300 y 500 segundos. Guarde y exporte las imágenes de lapso de tiempo como archivos de pila AVI o TIFF. Para analizar las imágenes de lapso de tiempo, abra la secuencia de imágenes de lapso de tiempo en ImageJ o Fiji y utilice la herramienta Canal dividido para dividir los canales.
En la imagen de canal verde de ocho bits, utilice la herramienta Línea segmentada para trazar una línea a lo largo de las trayectorias de las partículas utilizando la misma convención direccional deseada para todas las películas, de modo que la polaridad sea coherente dentro y a través de todas las celdas que se están estudiando. Haga doble clic en la herramienta Línea para ajustar el ancho de línea para que coincida con el grosor de la pista y ejecute la macro Dibujar Kymo del complemento Kymo ToolBox utilizando un ancho de línea de 10. Aparecerá un mensaje que pide calibrar la imagen en tiempo y espacio.
Una vez calibrados, se generarán kymographs y se pueden guardar como archivos TIFF. Para asignar trayectorias de partículas, utilice la herramienta Línea segmentada para realizar un seguimiento manual de cada partícula del kymograma durante toda la adquisición y utilice el gestor de ROI para registrar cada trayectoria de partícula como una región de interés. Guarde todas las regiones de interés por cada vídeo de lapso de tiempo para un análisis posterior y ejecute la macro Analizar Kymo del plugin Kymo ToolBox.
Se abrirá una ventana pidiendo definir la dirección exterior del movimiento de partículas desde el núcleo de la celda de interés desde el menú desplegable. La velocidad límite debe definirse de acuerdo con la sensibilidad del software para cada carga de interés y el ancho de línea debe ajustarse para que coincida con el grosor de cada trayectoria de partícula. Las coordenadas extrapoladas Registrar todos los datos y El registro deben ser para el cálculo de los distintos parámetros de transporte de carga.
Haga clic en Aceptar. Los datos calculados para las pistas individuales se agruparán por cifrógrafo y se guardarán en archivos de texto específicos de cada imagen. La combinación del tratamiento de la citosina arabinosa con la estrategia de purificación basada en el temblor enriquece la pureza de los cultivos de astrocitos sobre los protocolos tradicionales que incluyen el paso de purificación solamente.
La transfección basada en lipofección permite la expresión transitoria de proteínas a niveles óptimos para la toma de imágenes de células vivas sin causar toxicidad o afectar la viabilidad de los astrocitos. Del mismo modo, el uso de una sonda fluorescente permite el etiquetado rápido y eficiente de los orgánulos endolysosomal ácidos para el seguimiento de la dinámica de organelélica y los astrocitos. Los datos de lapso de tiempo de las imágenes se pueden utilizar para generar cifógrafos que rastrean el movimiento de la carga en tiempo y espacio.
En estos kymografos, el movimiento anterogrado de la carga indicada está representado por trayectorias con pendientes negativas, mientras que el movimiento retrógrado está representado por trayectorias con pendientes positivas. Las vesículas estacionarias aparecen como trayectorias verticales. En este análisis, la cuantificación del flujo de una carga específica a través de un área del astrocito reveló diferencias en el porcentaje de partículas modales entre las cargas que probablemente son representativas de su motilidad de línea base normal en la región del astrocito dentro de la cual se adquirieron las películas.
El mapeo preciso del cambio en la posición X, Y a lo largo de la escala de tiempo completa para cada partícula obtenida del cifógrafo también se puede utilizar para evaluar otros parámetros de movimiento, como la velocidad de la carga y la longitud de la carrera. Dado que este protocolo requiere cultivos de astrocitos de alta calidad y etiquetado eficiente de la carga, el tiempo de incubación del reactivo de transfección y el plazo de adquisición deben ajustarse para cada plásmido o carga de interés. Este protocolo se puede modificar para caracterizar eventos de transporte en astrocitos en respuesta a daños celulares, toxicidad, mutaciones patógenas, actividad sináptica o cambios en el entorno intra o extracelular.
