Este protocolo presenta información sobre las floraciones de algas y cómo monitorear las especies de algas tóxicas de manera efectiva. El procedimiento ayuda a proporcionar una alerta temprana de las floraciones de algas para proteger a la comunidad de los daños asociados. El análisis de metacódigo de barras puede detectar muchas especies en una muestra a la vez, pero requiere procedimientos complicados.
Este protocolo explica visualmente cada paso para ayudar a minimizar los errores humanos durante el análisis. Los procedimientos de microscopía serán demostrados por Henry Cameron de la Universidad de Antofagasta, la recolección de muestras por Jonathan Vilugron del Instituto de Fomento Pesquero, el pretratamiento de muestras por Karen Vergara de la Universidad de Los Lagos y el análisis de metacódigo de barras por Ignacio Rilling y Marco Campos de la Universidad de La Frontera. Comience recolectando tres litros de muestra de agua de un lugar objetivo.
Filtre un litro de agua para el análisis de ARNr 16S a través de una filtración en tándem para separar las bacterias vivas libres y las adheridas. A continuación, filtre otro litro de agua para el análisis de ARNr 18S a través de una sola filtración con una membrana de 0,2 micras. Luego, usando tijeras quirúrgicas estériles, corte la membrana filtrada por la mitad, envuelva una mitad con papel de aluminio para su almacenamiento y con la otra mitad proceda a la extracción de ADN con el método Chelex.
Para el análisis microscópico, transfiera un mililitro de la muestra de agua a un portaobjetos de rejilla de un mililitro usando una pipeta. Observe la muestra bajo un microscopio y registre los nombres y la cantidad de las especies de fitoplancton. Limpie las pipetas en el gabinete de la campana laminar con etanol al 70%, seguido de exposición a los rayos UV durante 30 minutos.
Para la primera generación de amplicones de PCR, alícuota 22,5 microlitros de la mezcla maestra en una tira de ocho tubos seguida de 2,5 microlitros de la muestra de ADN, luego ejecute el primer ciclo de PCR. A continuación, prepare 100 mililitros de un gel TBE de agarosa al 2% que contenga 10 microlitros de una mancha de gel de ácido nucleico. Una vez que el gel esté listo, cargue una mezcla que contenga 1,5 microlitros de un tinte de carga de ADN y cuatro microlitros del producto de PCR y realice la electroforesis a 100 voltios durante 30 minutos.
Luego, tome una imagen del gel bajo luz UV y confirme la presencia de una banda de par de bases de 500 a 600. Los amplicones faltantes a veces se pueden resolver diluyendo la muestra a 1. 000 veces con agua. A continuación, use un sistema de limpieza de ADN basado en perlas magnéticas para limpiar los primeros productos de PCR, luego transfiera 20 microlitros de cada primer producto de PCR limpiado a una nueva placa de 96 pocillos y selle la placa con una película de microsellado.
Guarde el plato a menos 20 grados centígrados hasta el siguiente paso. Para la indexación por segunda PCR, después de diluir todos los cebadores de índice uno e índice dos a una concentración micromolar con agua de grado PCR en ocho tiras de PCR de tubo, coloque los cebadores de índice uno en una fila horizontal e indexe dos cebadores en una fila vertical. Luego, usando una pipeta multicanal a 2.5 microlitros de índice un cebador a cada pozo de una nueva placa de 96 pocillos.
A continuación, agregue 12.5 microlitros de una formulación lista para el inicio en caliente a cada pozo. Luego, agregue 2.5 microlitros de imprimación de índice dos y 7.5 microlitros del primer producto de PCR purificado a cada pozo. Después de mezclar mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 10 veces, cubra la placa con una película microsellada y ejecute el segundo ciclo de PCR.
Una vez completada la PCR, coloque la cinta de pantalla de ADN en un analizador de fragmentos. Mezcle dos microlitros de tampón de muestra en tres microlitros del segundo amplicón pcrista en nuevas tiras de ocho tubos e inserte las tiras en el analizador de fragmentos para comenzar el análisis. Asegúrese de que los segundos amplicones de PCR sean aproximadamente 613 pares de bases para los genes 16S y 18S rRNA.
Purificar los segundos productos de PCR utilizando un sistema de limpieza de ADN de perlas magnéticas, como se demostró anteriormente. Luego mida su concentración de ADN usando un espectrofotómetro de cuantificación de ácidos nucleicos. En una nueva placa de 96 pocillos de 200 microlitros, diluya cada segundo producto de PCR purificado con agua estéril de PCR a cuatro nanomoles.
Siguiente paso adelante, el protocolo debe realizarse sin detenerse. Alícuota tres microlitros de cada segundo producto de PCR diluido en un nuevo tubo estéril de 1,5 mililitros para crear una biblioteca agrupada. Mantenga siempre el tubo a cuatro grados centígrados.
Un día antes de la secuenciación, retire un cartucho de reactivo precargado listo para usar de menos 20 grados centígrados y colóquelo a cuatro grados centígrados para descongelarlo. El día de la secuenciación, coloque un bloque de calor adecuado para tubos de centrífuga de 1,5 mililitros a 96 grados centígrados y coloque el tampón de hibridación en hielo. Luego, diluya el hidróxido de sodio de grado molecular con agua y diluya una biblioteca de control lista para usar con tampón TE.
Mezcle 16 microlitros de los cuatro nanomoles o la biblioteca de muestras agrupadas con cuatro microlitros de la biblioteca de control en un nuevo tubo etiquetado como uno. Luego, mezcle 10 microlitros de la muestra del tubo uno con 10 microlitros de hidróxido de sodio en un tubo nuevo etiquetado como dos. Después del vórtice y un breve giro, incube el tubo dos a temperatura ambiente durante cinco minutos, luego agregue 980 microlitros de tampón de hibridación.
A continuación, en un nuevo tubo etiquetado como tres, mezcle 260 microlitros de la muestra del tubo dos con 390 microlitros de tampón de hibridación. Después de mezclar el contenido invirtiendo el tubo, incube a 96 grados centígrados durante dos minutos, seguido de la incubación en hielo durante dos minutos. A continuación, retire el cartucho del refrigerador y configure la hoja de muestra para la secuenciación con cada adaptador de índice uno e índice dos correspondientes.
Después de extraer la celda de flujo del kit MiSeq V3, limpie suavemente la celda de flujo con agua estéril de PCR de grado molecular. Cargue todo el volumen del tubo tres en el cartucho. Luego, en el software de operación del instrumento, seleccione la secuenciación y siga las instrucciones para insertar la celda de flujo, el búfer de incorporación y el cartucho.
Finalmente, cargue la hoja de muestra y presione Ejecutar para iniciar la reacción. Esta secuencia dura de tres a cinco días. El análisis de metabarcódigo de ARNr 18S para identificar especies de algas presentes en el agua de mar recolectado en Metri Puerto Montt, Chile, el 19 de febrero de 2019, arrojó 13, 750 lecturas, con más de 30 especies de algas.
La especie Navicula fue el algo dominante con una abundancia relativa del 70,73% Además, se observó suficiente abundancia para las especies Micromonas, Chaetoceros, Scrippsiella y Prorocentrum. La especie Pseudochattonella, uno de los principales causantes de las floraciones de algas nocivas chilenas, tiene una abundancia del 0,52%. De acuerdo con el análisis del gen 18S rRNA, la observación microscópica mostró a Navicula como la especie dominante y a Prorocentrum como una especie menor.
El 12,6% de las células de fitoplancton pequeñas y no identificables registradas por microscopía podrían ser Micromonas, según los resultados del ARNr 18S. El análisis del metacódigo de barras 16S rRNA para identificar especies bacterianas en la misma muestra de agua mostró 31, 758 lecturas con más de 30 especies bacterianas. La especie bacteriana de vida libre dominante fue Amylibacter, con una abundancia relativa del 20,02%, seguida de Cladella con un 13,53% y Algiphilus con un 7,06%La abundancia relativa de dos especies de algas tóxicas, Alexandrium y Pseudochattonella, se traza en el tiempo para encontrar un patrón de crecimiento único.
Se traza la abundancia relativa de todos los géneros bacterianos en órdenes detectados a partir del agua de mar durante cinco meses y se hace tiempo para analizar el cambio poblacional de ciertos organismos. Es crucial estar más limpio. La contaminación de la muestra debe evitarse con una toallita con alcohol, luz UV o autoclave del material.
Las soluciones diluidas no deben reutilizarse y los tubos siempre deben taparse. La detección de algas por metacódigo de barras debe combinarse con microscopía. La especie dominante puede ser confirmada por microscopía asegurando que no haya error humano durante los procesos de metacódigo de barras.
Las floraciones de algas nocivas dañan el ecosistema marino y la economía costera. En Chile, las floraciones de algas matan a los salmones de granja, dañando los cultivos de agua. Este análisis de metacódigo de barras aumentará la eficiencia de las advertencias de floración en Chile.
