Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Erzeugung von aus Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zellen aus der Maus. Verfahren mit tierischen Probanden wurden von der Institution Animal Ethics Committee der Nanjing Medical University genehmigt.One.Introduction. Mit der Zunahme der Tumorimmunitätsforschung steigt die Nachfrage nach DC-Zellen allmählich an.
DCs sind jedoch in allen Geweben selten. Die traditionelle Methode, hauptsächlich die Differenzierung von Knochenmark in DCs zu induzieren, ist kompliziert und kostspielig. Zwei. Isolierung des Knochenmarks und Vorbereitung der BM-Zellen Wir opfern Mäuse und fixieren uns auf dem Operationstisch der Maus.
Schneiden Sie die Haut der linken freiliegenden Muskeln und der Oberschenkelarterie ab. Schneiden Sie die Oberschenkelarterie nicht direkt ab. Andernfalls verursacht es starke Blutungen und kontaminiert das Sichtfeld.
Schneiden Sie alle Muskeln um den Oberschenkelknochen ab. Strecken Sie langsam die unteren Gliedmaßen der Maus nach außen, bis der Vorfall des Hüftkopfes und kann beobachtet werden. Trennen Sie die unteren Gliedmaßen vom Körper.
Schneiden Sie das Hinterbein ab, um einen freien und vollständigen Femur zu erhalten. Entfernen Sie die Muskeln mit Gaze. Zerreißen Sie die Muskeln nicht direkt.
Der Oberschenkelknochen von Mäusen ist zerbrechlich. Legen Sie den Femur für zwei bis fünf Minuten in 75% Alkohol. Drei. Injektionskultur von BMDC Spülen Sie den Restalkohol mit PBS ab.
Klemmen Sie den mittleren und unteren Teil des Femurs mit einer hämostatischen Pinzette und klemmen Sie das untere Ende des Femurs mit einer anderen hämostatischen Pinzette ein. Die hämostatische Pinzette wird buchstäblich auf den Femur aufgetragen und der Femur wird von der Epiphysenlinie gebrochen. Verwenden Sie eine ml-Spritze, um die Knochenmarkhöhle aus der Epiphysenlinie zu durchstechen.
Verwenden Sie das komplette Medium zwei Teile spülen Sie die Knochenmarkhöhle, bis der Knochen weiß wird. Spülflüssigkeiten sammeln. Ergänzung des kompletten Mediums mit GM CSF/IL-4 bis 24ml und Saat in einer 6-Well-Platte mit 4ml pro Well. Vier. Ergebnisse.
Ersetzen Sie nach zwei Tagen alle Medien, die GM-CSF/IL-4 enthalten. Die Hälfte ersetzte das komplette Medium, das GM-CSF/IL-4 enthielt, am vierten und sechsten und achten Tag. Die Anzahl der Zellen erreichte am siebten Tag einen Höhepunkt und nahm dann allmählich ab.
DC-Zellen bildeten eine große Anzahl von Synapsen, die eine typische reife DC-Zellmorphologie zeigten. Durchfluss-Submetrische Analysen zeigen, dass das Verhältnis von CD11c am sechsten Tag einen Anstieg des breiten Verhältnisses um 71% auf 96,1% am 10. Tag auferlegte. Die Expression von CD11c, CD80 und MSC2 nahm mit zunehmender Kultivierungszeit allmählich zu. Fünf. Fazit.
Kurz gesagt, wir haben ein wirtschaftliches und effizientes Protokoll für die Isolierung und Erzeugung von dendritischen Zellen aus Knochenmark von Mäusen erstellt, das nur 10 Minuten benötigt, um Knochenmarkzellen zu trennen. Eine hohe Anzahl von hochreinen DCs wurde nach sechs bis sieben Tagen Kultur mit 10 ng pro ml, GM-CSF und IL-4 geerntet.
