마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하는 경제적이고 효율적인 프로토콜. 동물 과목과 관련된 절차는 난징 의과 대학의 기관 동물 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.One.Introduction. 종양 면역 연구의 증가와 함께, DC 세포에 대한 수요는 점차 증가하고 있습니다.
그러나 DC는 모든 조직에서 드뭅니다. 주로 골수를 DC로 분화시키는 전통적인 방법은 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 2. 골수의 분리 및 BM 세포의 준비 우리는 마우스를 희생시키고 마우스 수술대에 고정시킵니다.
왼쪽 노출 된 근육과 대퇴 동맥의 피부를 자르십시오. 대퇴 동맥을 직접 자르지 마십시오. 그렇지 않으면 심한 출혈을 일으키고 시야를 오염시킵니다.
대퇴골 주변의 모든 근육을 자르십시오. 대퇴골 머리가 탈출 할 때까지 마우스의 하지를 천천히 바깥쪽으로 뻗어 관찰 할 수 있습니다. 몸에서 하지를 분리하십시오.
자유롭고 완전한 대퇴골을 얻기 위해 뒷다리를 자르십시오. 거즈를 사용하여 근육을 제거하십시오. 근육을 직접 찢지 마십시오.
생쥐의 대퇴골은 깨지기 쉽습니다. 대퇴골을 75 % 알코올에 두 분에서 5 분 동안 넣으십시오. 3. BMDC의 주입 배양은 잔류 알코올을 PBS로 헹구었다.
지혈 포셉으로 대퇴골의 중간 및 하단 부분을 클램프하고 대퇴골의 하단 끝을 다른 지혈 포셉으로 클램프하십시오. 지혈 포셉은 문자 그대로 대퇴골에 적용되고 대퇴골은 epiphyseal 라인에서 부서집니다. 한 ml 주사기를 사용하여 epiphyseal 라인에서 골수강을 관통하십시오.
완전한 매체를 사용하여 뼈가 흰색이 될 때까지 골수강을 플러시하십시오. 플러싱 유체를 수집합니다. GM CSF/IL-4를 함유하는 완전한 배지를 24ml로 보충하고, 웰당 4ml로 6-웰 플레이트에 시드한다. 네 가지.결과.
이틀 후, GM-CSF/IL-4를 함유하는 모든 배지를 교체한다. 절반은 네 번째와 여섯 번째와 여덟 번째 날에 GM-CSF / IL-4를 포함하는 완전한 배지를 대체했습니다. 세포의 수는 일곱째 날에 절정에 도달했다가 점차 감소했다.
DC 세포는 전형적인 성숙 DC 세포 형태를 나타내는 다수의 시냅스를 형성하였다. 유동 서브 메트릭 분석은 CD11c의 비율이 6일째 날에 71%를 부과하고, 넓은 비율이 10일째에 96.1%로 증가한다는 것을 보여준다. CD11c, CD80 및 MSC2의 발현은, 배양 시간 증가에 따라 점차적으로 증가하였다. 다섯.결론.
요컨대, 우리는 쥐로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하기위한 경제적이고 효율적인 프로토콜을 수립했으며, 골수 세포를 분리하는 데 10 분 밖에 걸리지 않습니다. 많은 수의 고순도 DCs를 ml 당 10ng, GM-CSF 및 IL-4로 6 내지 7일 배양한 후에 수확하였다.
