Protocole économique et efficace d’isolement et de génération de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse à partir de souris. Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université de médecine de Nanjing.One.Introduction. Avec l’augmentation de la recherche sur l’immunité tumorale, la demande de cellules DC augmente progressivement.
Cependant, les DC sont rares dans tous les tissus. La méthode traditionnelle consistant principalement à induire la différenciation de la moelle osseuse en DC est compliquée et coûteuse. Deux. Isolement de la moelle osseuse et préparation des cellules BM Nous sacrifions des souris et fixons sur la table d’opération de la souris.
Couper la peau des muscles exposés gauches et de l’artère fémorale. Ne coupez pas directement l’artère fémorale. Sinon, il provoquera des saignements abondants et contaminera le champ de vision.
Coupez tous les muscles autour du fémur. Étirez lentement les membres inférieurs de la souris vers l’extérieur jusqu’à ce que le prolapsus de la tête fémorale puisse être observé. Séparez les membres inférieurs du corps.
Coupez la patte arrière pour obtenir un fémur libre et complet. Retirez les muscles à l’aide de gaze. Ne déchirez pas directement les muscles.
Le fémur des souris est fragile. Placez le fémur dans 75% d’alcool pendant deux à cinq minutes. Trois. Culture injectable de BMDC Rincer l’alcool résiduel avec du PBS.
Serrez la partie centrale et inférieure du fémur avec une pince hémostatique et serrez l’extrémité inférieure du fémur avec une autre pince hémostatique. Les pinces hémostatiques sont appliquées littéralement sur le fémur et le fémur est brisé de la ligne épiphysaire. Utilisez une seringue d’un ml pour percer la cavité de la moelle osseuse de la ligne épiphysaire.
Utilisez un milieu complet en deux parties pour rincer la cavité de la moelle osseuse jusqu’à ce que l’os devienne blanc. Recueillir les liquides de rinçage. Compléter le milieu complet contenant du GM CSF/IL-4 à 24 ml et semer dans une plaque de 6 puits avec 4 ml par puits. Quatre.Résultats.
Après deux jours, remplacer tout milieu contenant du GM-CSF/IL-4. La moitié a remplacé le milieu complet contenant du GM-CSF/IL-4, les quatrième, sixième et huitième jours. Le nombre de cellules a atteint un pic le septième jour, puis a diminué progressivement.
Les cellules DC ont formé un grand nombre de synapses montrant une morphologie typique des cellules DC matures. Les analyses de la sous-métrique de flux montrent que le ratio de CD11c a imposé ce que 71% le sixième jour, le ratio large augmente à 96,1% le 10ème jour. L’expression de CD11c, CD80 et MSC2 augmentait progressivement avec l’augmentation du temps de culture. Cinq.Conclusion.
En bref, nous avons établi un protocole économique et efficace pour isoler et générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse à partir de souris, ce qui ne prend que 10 minutes pour séparer les cellules de la moelle osseuse. Un grand nombre de DC de haute pureté a été récolté après six à sept jours de culture avec 10 ng par ml, GM-CSF et IL-4.
