マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および生成する経済的かつ効率的なプロトコル。動物被験者に関する手続きは、南京医科大学の機関動物倫理委員会によって承認されています。腫瘍免疫研究の増加に伴い、DC細胞の需要は徐々に増加しています。
しかし、DCはすべての組織において稀である。主に骨髄をDCに分化誘導する従来の方法は複雑で費用がかかる。2。骨髄の単離およびBM細胞の調製 我々はマウスを屠殺し、マウス手術台に固定する。
左露出した筋肉と大腿動脈の皮膚を切断する。大腿動脈を直接切断しないでください。さもなければ、それは重い出血を引き起こし、視野を汚染するでしょう。
大腿骨の周りのすべての筋肉を切断します。マウスの下肢を大腿骨頭の脱出までゆっくりと外側に伸ばし、観察することができる。下肢を体から離します。
自由で完全な大腿骨を得るために後肢を切る。ガーゼを使って筋肉を取り除きます。筋肉を直接引き裂かないでください。
マウスの大腿骨は壊れやすいです。大腿骨を75%アルコールに2〜5分間入れます。3。BMDCの注入培養はPBSで残留アルコールをすすいでください。
大腿骨の中央部および底部を止血鉗子でクランプし、大腿骨の下端を別の止血鉗子でクランプする。止血鉗子は文字通り大腿骨に適用され、大腿骨は骨端線から壊れる。骨端ラインから骨髄腔を突き刺すために1mlシリンジを使用する。
骨が白くなるまで骨髄腔を洗い流す完全な培地2つの部分を使用してください。フラッシング液を集める。GM CSF/IL-4を含む完全培地を24mlに補充し、1ウェルあたり4mlの6ウェルプレートに播種する。4.結果
2日後、GM-CSF/IL-4を含むすべての培地を交換してください。4日目、6日目、8日目にGM-CSF/IL-4を含む完全培地を半分交換した。細胞数は7日目にピークに達し、その後徐々に減少した。
DC細胞は、典型的な成熟DC細胞形態を示す多数のシナプスを形成した。フローサブメトリック分析は、CD11cの比率が6日目に71%のものを課し、広い比率が10日目に96.1%に増加することを示す。CD11c、CD80およびMSC2の発現は、培養時間の増加とともに徐々に増加した。5.まとめ
要するに、骨髄細胞の分離に10分しかかからないマウス由来の樹状細胞を単離・生成するための経済的で効率的なプロトコールを確立したのです。多数の高純度DCを、1mlあたり10ng、GM−CSF、およびIL−4で6〜7日間の培養後に回収した。
