Protocolo Econômico e Eficiente de Isolar e Gerar Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea a partir do rato. Os procedimentos envolvendo matérias animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Instituição da Universidade Médica de Nanjing.One.Introdução. Com o aumento da pesquisa de imunidade tumoral, a demanda por células DC está aumentando gradualmente.
No entanto, os DCs são raros em todos os tecidos. O método tradicional de induzir principalmente a diferenciação da medula óssea em DCs é complicado e caro. Dois. Isolamento da medula óssea e preparação de células BM Sacrificamos ratos e fixamos na mesa de operação do mouse.
Corte a pele dos músculos expostos à esquerda e artéria femoral. Não corte diretamente a artéria femoral. Caso contrário, causará sangramento severo e contaminará o campo de visão.
Corte todos os músculos ao redor do fêmur. Estique lentamente os membros inferiores do rato para fora até o prolapso da cabeça femoral e possa ser observado. Separe os membros inferiores do corpo.
Corte a perna traseira para obter um fêmur livre e completo. Remova os músculos usando gaze. Não rasgue os músculos diretamente.
O fêmur de camundongos é frágil. Coloque o fêmur em 75% de álcool por dois a cinco minutos. Três. Cultura de injeção de BMDC Enxágue o álcool residual com PBS.
Aperte a parte média e inferior do fêmur com fórceps hemostáticos, e aperte a extremidade inferior do fêmur com outra fórceps hemostáticos. As fórceps hemostáticas são aplicadas literalmente ao fêmur e o fêmur é quebrado da linha epífise. Use uma seringa ml para perfurar a cavidade da medula óssea da linha epífise.
Use duas partes médias completas que lavem a cavidade da medula óssea até que o osso fique branco. Coletar fluidos de descarga. Complementando o meio completo contendo GM CSF/IL-4 a 24ml, e semente em uma placa de 6 poços com 4ml por poço. Quatro.resultados.
Após dois dias, substitua todos os meios que contenham GM-CSF/IL-4. Metade substituiu meio completo contendo GM-CSF/IL-4, no quarto e sexto e oitavo dia. O número de células atingiu um pico no sétimo dia e depois diminuiu gradualmente.
As células DC formaram um grande número de sinapsis mostrando uma morfologia típica de células DC maduras. Análises submétricas de fluxo mostram que a razão de CD11c impôs o que 71% no sexto dia, aumento da relação ampla para 96,1% no 10º dia. A expressão de CD11c, CD80 e MSC2, aumentou gradualmente com o aumento do tempo de cultivo. Cinco.conclusão.
Em suma, estabelecemos um protocolo econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea a partir de camundongos, que leva apenas 10 minutos para separar as células da medula óssea. Um alto número de DCs de alta pureza foi colhido após seis a sete dias de cultura com 10ng por ml, GM-CSF e IL-4.
