Protocollo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo dal topo. Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institution Animal Ethics Committee dell'Università di Medicina di Nanchino.One.Introduzione. Con l'aumento della ricerca sull'immunità tumorale, la domanda di cellule DC sta gradualmente aumentando.
Tuttavia, le DC sono rare in tutti i tessuti. Il metodo tradizionale di indurre principalmente la differenziazione del midollo osseo in DC è complicato e costoso. Due. Isolamento del midollo osseo e preparazione delle cellule BM Sacrifichiamo i topi e fissiamo sul tavolo operatorio del topo.
Tagliare la pelle dei muscoli esposti a sinistra e dell'arteria femorale. Non tagliare direttamente l'arteria femorale. Altrimenti, causerà forti emorragie e contaminerà il campo visivo.
Taglia tutti i muscoli intorno al femore. Allungare lentamente gli arti inferiori del topo verso l'esterno fino al prolasso della testa del femore e può essere osservato. Separare gli arti inferiori dal corpo.
Tagliare la zampa posteriore per ottenere un femore libero e completo. Rimuovere i muscoli usando una garza. Non strappare direttamente i muscoli.
Il femore dei topi è fragile. Mettere il femore al 75% di alcol per due o cinque minuti. Tre. Coltura per iniezione di BMDC Risciacquare l'alcol residuo con PBS.
Blocca la parte centrale e inferiore del femore con una pinza emostatica e blocca l'estremità inferiore del femore con un'altra pinza emostatica. Le pinze emostatiche vengono applicate letteralmente al femore e il femore viene rotto dalla linea epifisaria. Utilizzare una siringa da un ml per perforare la cavità del midollo osseo dalla linea epifisaria.
Utilizzare mezzo completo due parti lavare la cavità del midollo osseo fino a quando l'osso diventa bianco. Raccogliere fluidi di lavaggio. Integrando il mezzo completo contenente GM CSF / IL-4 a 24 ml e seme in un piatto a 6 pozzetti con 4 ml per pozzetto. Four.Risultati.
Dopo due giorni, sostituire tutti i mezzi contenenti GM-CSF/IL-4. Metà ha sostituito il mezzo completo contenente GM-CSF/IL-4, il quarto, il sesto e l'ottavo giorno. Il numero di cellule ha raggiunto un picco il settimo giorno e poi è diminuito gradualmente.
Le cellule DC hanno formato un gran numero di sinapsi mostrando una tipica morfologia di cellule DC mature. Le analisi submetriche di flusso mostrano che il rapporto di CD11c ha imposto ciò che il 71% il sesto giorno, l'ampio rapporto aumenta al 96,1% il 10 ° giorno. L'espressione di CD11c, CD80 e MSC2, è aumentata gradualmente con l'aumentare del tempo di coltivazione. Cinque.Conclusione.
In breve, abbiamo stabilito un protocollo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo dai topi, che richiede solo 10 minuti per separare le cellule del midollo osseo. Un numero elevato di DC ad alta purezza è stato raccolto dopo sei-sette giorni di coltura con 10ng per ml, GM-CSF e IL-4.
