El protocolo proporciona células endoteliales de crecimiento sanguíneo altamente proliferativo que se pueden usar para diversas investigaciones de ingeniería de tejidos, terapia celular y modelado de enfermedades. Esta técnica produce consistentemente muchas células de una sola extracción de sangre. Para que esta técnica tenga éxito, es crucial introducir rápidamente las células en el medio de cultivo y el entorno de la incubadora lo antes posible.
Primero, diluya la solución de heparina a 100 unidades por mililitro en solución salina estéril. Agregue de tres a cuatro mililitros de solución de heparina a cada uno de los dos tubos cónicos de 50 mililitros y dos jeringas de 60 mililitros. Luego, extraiga 1, 000 unidades por solución de mililitro de heparina sin diluir en un tubo de extensión.
Conecte una aguja de calibre 19 a un extremo del tubo de extensión lleno de heparina y una jeringa de 60 mililitros que contenga heparina al otro extremo del tubo de extensión. A continuación, limpie el área de la ingle femoral de un cerdo anestesiado con una solución exfoliante de Betadine. Perfore la vena o arteria femoral con una aguja de calibre 19 y de uno a dos mililitros por segundo, extraiga lentamente 50 mililitros de sangre en la jeringa.
Dejando la aguja en su lugar, doble inmediatamente el tubo de extensión y desconecte la jeringa de 60 mililitros. Transfiera lentamente la sangre a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga heparina. Tapa firmemente el tubo cónico, invierte suavemente el tubo varias veces para mezclarlo y colócalo en hielo.
Conecte la jeringa restante de 60 mililitros que contiene heparina al tubo de extensión. Despliega el tubo de extensión y extrae lentamente 50 mililitros de sangre adicionales en la jeringa. Retire inmediatamente la aguja de la arteria o vena y extraiga lentamente la sangre restante del tubo de extensión a la jeringa.
Desconecte la jeringa de 60 mililitros del tubo de extensión y transfiera lentamente la sangre al tubo cónico de 50 mililitros que contiene heparina restante. Tapa herméticamente el tubo cónico de 50 mililitros, invierte suavemente unas cuantas veces para mezclar y colócalo en hielo. Aplique hemostasia de presión en el área de la ingle femoral del cerdo.
Diluir la sangre uno a uno con PBS en cuatro tubos cónicos de 50 mililitros. Agregue 25 mililitros de solución de gradiente de densidad lista para usar a temperatura ambiente a ocho tubos cónicos de 50 mililitros. Pipetear lentamente 25 mililitros de solución salina de sangre dentro de cada tubo cónico de 50 mililitros que contenga solución de gradiente de densidad sosteniendo el tubo en un ángulo agudo con respecto a la punta de la pipeta.
Centrifugar los tubos durante 30 minutos a 560 g y a temperatura ambiente. Recoja cuidadosamente la capa leucocitaria, que es la capa turbia de células mononucleares por encima de la solución de gradiente de densidad y por debajo del plasma transparente, de cada tubo con una pipeta delgada y distribúyala uniformemente en dos nuevos tubos cónicos de 50 mililitros. Deseche la solución de gradiente de densidad que contiene tubos.
Para cubrir una placa de seis pocillos con fibronectina, haga una solución madre de fibronectina plasmática humana diluyéndola a un miligramo por mililitro en agua estéril. Haga 3.6 mililitros de una solución de trabajo de fibronectina diluyendo 600 microlitros de solución madre de fibronectina en tres mililitros de PBS. Transfiera 600 microlitros de la solución de trabajo de fibronectina a cada pocillo de una placa de seis pocillos y balancee suavemente hasta que esté uniformemente cubierto.
Y aspire suavemente la solución fuera de cada pocillo. Para lavar las células mononucleares mientras espera que la fibronectina se cubra, rellene los tubos con hasta 45 mililitros de PBS, centrifugar durante cinco minutos a 560 X g y cuatro grados centígrados con baja rotura. Aspire el sobrenadante de ambos tubos.
Resuspender cada pellet celular en 25 mililitros de PBS. Resuspenda cada pellet celular en cinco mililitros de PBS y agregue 15 mililitros de solución de cloruro de amonio al 0,8% a cada tubo. Lave las celdas como antes agregando PBS.
Aspire el sobrenadante de ambos tubos. Resuspender cada pellet celular en 25 mililitros de PBS. Resuspender cada pellet celular en seis mililitros de medio de cultivo EGM-2 suplementado con 10% FBS y 1X solución antibiótico-antimicótica.
Transfiera suavemente dos mililitros de la suspensión celular a cada pocillo de la placa de seis pocillos recubierta de fibronectina y rocíe suavemente hasta que esté uniformemente cubierta. 24 horas después de sembrar las células, agregue suavemente un mililitro de medio de cultivo fresco a cada pocillo. Al día siguiente, aspire suavemente 1.5 mililitros de medio de cultivo de cada pocillo y reemplácelo con 1.5 mililitros de medio de cultivo fresco.
Durante los próximos cinco días, cambie suavemente el medio de cultivo con dos mililitros de medio de cultivo fresco por pocillo. Visualice regularmente los cultivos celulares bajo microscopía de luz objetiva 4X de baja potencia. La morfología de las células cultivadas se observó desde el inicio del cultivo hasta que se observaron colonias BOEC.
Una población más pequeña de células adherentes comenzó a adherirse a las placas de cultivo y crecer, mientras que las células no adherentes se eliminaron con cambios en el medio de cultivo. Las colonias aparecieron por primera vez el sexto día como una colección de células endoteliales que proliferan radialmente hacia afuera desde un punto central. A medida que avanzaba el cultivo, las colonias celulares se volvieron más densas y mostraron una morfología de adoquines similar a las células endoteliales maduras.
Se utilizó microscopía de contraste de fase bidimensional para obtener imágenes de la formación de tubos en medio libre de suero y medio de crecimiento completo. Las células en ambas condiciones de medios experimentaron diferenciación morfológica y se organizaron rápidamente en extensas redes de estructuras en forma de tubo capilar. Los BOEC se caracterizaron además por la expresión del marcador de células endoteliales maduras CD31 o de la molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias uno.
Los BOEC mostraron una expresión uniforme de CD31. Además, el análisis de citometría de flujo de BOEC con anticuerpo CD14 AF 700 en comparación con el control positivo confirmó la ausencia de EPC, ya que la célula se tiñó negativa para el marcador de monocitos CD14 en comparación con el grupo de control positivo de PBMC. La tinción CD14 positiva se muestra en azul y las células no teñidas se muestran en rojo.
Durante la recolección de sangre, es esencial recolectar la mayor cantidad posible de la capa de pelaje leucocitario mientras se recolecta la menor cantidad posible de las capas adyacentes. Esta técnica ha permitido estudiar nuevas estrategias para endotelizar dispositivos cardiovasculares implantables utilizando un modelo de cerdo con células endoteliales autólogas de crecimiento sanguíneo.
