El reflejo H permite la validación electrofisiológica de la integridad de los circuitos neurológicos. Presentamos un protocolo terminal para cuantificar el reflejo H directamente en los nervios de la pata delantera en ratones. A diferencia de los registros transcutáneos convencionales bastante inespecíficos de los nervios, los resultados son menos variables entre los ratones y los días de medición.
Similar a los registros de reflejo H en pacientes, la cuantificación precisa permite la caracterización electrofisiológica en modelos de enfermedad, por ejemplo, lesión de la médula espinal y accidente cerebrovascular. El protocolo requiere sólidas habilidades experimentales para trabajar con equipos quirúrgicos en ratones.
Si no está seguro de cómo separar los nervios del tejido conectivo y los vasos sanguíneos, practique primero. La demostración del procedimiento estará a cargo de Frederique Wieters, una estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, coloque el ratón C57 negro/6J anestesiado para adultos de 8 a 16 semanas de edad en la almohadilla térmica cubierta y espere hasta que el ratón esté tranquilo, la respiración sea estable y los reflejos estén ausentes.
Gire el ratón sobre su espalda. Luego, fije las patas delanteras con cinta adhesiva. Coloque la cinta de manera que los electrodos de medición se inserten fácilmente en las patas delanteras.
Para medir la temperatura de un ratón, inserte una sonda rectal y fíjela con cinta adhesiva. Aplique ungüento para los ojos para evitar que los ojos se sequen. Retire el pelaje con cuidado con un par de tijeras finas y redondeadas mientras levanta la piel con pinzas.
Posteriormente, haga una incisión de un centímetro en la piel a lo largo del eje ventroposterior de la pata delantera con un par de tijeras finas y redondeadas. Retire con cuidado el tejido conectivo y exponga el músculo y el nervio inferiores. Luego retire el músculo pectoral profundus expuesto usando fórceps para evaluar el nervio mediano.
Retire pequeñas cantidades de sangre y líquido tisular con papel de seda blando. Luego, corte cuidadosamente el seno o el músculo axilar de arriba a abajo para exponer el haz de nervios. Libere el haz de nervios del tejido conectivo y muscular en una longitud de aproximadamente 1,5 centímetros.
Separe cuidadosamente el nervio cubital y el nervio mediano de la pata delantera con una pipeta de vidrio doblada. El nervio superior es el nervio cubital y el inferior es el nervio mediano. Coloque los electrodos del gancho estimulador en paralelo a una distancia de 0,5 a un milímetro y use un micromanipulador para colocar el gancho doble cerca del nervio.
Use el gancho de vidrio para levantar el nervio cubital sobre los electrodos del gancho de estimulación. Luego, retire el electrodo con el nervio y sepárelo de los otros nervios. Coloque los electrodos a lo largo del eje largo de la pata para reducir la diafonía entre los músculos.
Seque superficialmente los ganchos de electrodos unidos al nervio y aplique vaselina con una jeringa para proporcionar aislamiento eléctrico del tejido adyacente. Para medir el reflejo H, coloque los electrodos de electromiografía por vía intramuscular en la pata delantera. Luego, coloque el electrodo de referencia por vía subcutánea en la extremidad posterior, sostenido por una pinza de cocodrilo en miniatura.
Cuando se enciende el estimulador, observe una estimulación exitosa como pequeñas contracciones de la pata delantera. La corriente de estimulación mínima para provocar la onda M y pequeñas contracciones visibles en la pata delantera es de entre 10 y 50 microamperios. Realice la estimulación nerviosa 15 veces con pulsos de 0,2 milisegundos de duración cada una.
Con pausas de dos minutos entre los conjuntos de estímulos, la frecuencia aumenta de 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 a 5 hercios. Aquí se muestra una ilustración de la grabación establecida en las vías para medir el reflejo de Hoffman y la respuesta muscular. Se evaluó la relación entre la amplitud de la onda H y M.
El estímulo y el artefacto de estimulación respectivo se establecieron en cero milisegundos, seguidos por la onda M directa y el pico más pequeño posterior que representa la onda H. La onda M ocurre aproximadamente dos milisegundos después de la estimulación, y la onda H después de seis a ocho milisegundos debido al mayor tiempo de tránsito a través de la médula espinal. Junto a la separación de los nervios, la aplicación de vaselina al electrodo y también entre los dos ganchos son críticos.
Este es un experimento terminal. En nuestro laboratorio, esta técnica proporcionó una nueva referencia estándar de oro para las grabaciones transcutáneas del reflejo H.
