Este protocolo describe un método no invasivo para inducir dolor de espalda crónico en ratones durante un máximo de 10 semanas, que se puede realizar de forma rápida y fiable con un entrenamiento mínimo. El aspecto más difícil de esta técnica es reconocer cómo se siente la inyección de ligamento frente a la inyección de músculo. Sentir resistencia al contacto indica una inyección de ligamentos.
La ausencia de resistencia significa que la aguja podría estar en el músculo o en la cavidad abdominal. Para empezar, toma una superficie plana estéril para colocar el ratón. Luego, coloque una estación de recuperación de almohadillas térmicas junto a la configuración de la cirugía para transferir inmediatamente a los ratones después de la inyección.
A continuación, prepare la uroquinasa y una jeringa Hamilton. Extrae la solución de antemano para minimizar el tiempo que el ratón pasa bajo anestesia. Después de anestesiar al ratón, use dos dedos para ubicar los segmentos lumbares de la columna vertebral en L2 y L3 debajo de la caja torácica y verifique el sitio de inyección.
Coloque la punta de la jeringa Hamilton junto a la columna vertebral. Coloque la jeringa en un ángulo de aproximadamente 45 grados en el ligamento inmediatamente adyacente al hueso. Inserte la punta de la aguja suavemente, pero con firmeza, en el ligamento e inyecte lentamente hasta que se hayan inyectado los cinco microlitros.
Retire la aguja suave y lentamente. Luego, coloque el mouse en la estación de recuperación de calor hasta que se despierte y se vuelva móvil. Revise a los ratones durante una hora después de la cirugía para asegurarse de que toda la función motora normal continúe.
Después de la cirugía, revise el peso y el sitio de inyección de los ratones diariamente durante una semana para prevenir cualquier infección o complicación. Antes de la prueba, mueva a cada animal a un cubículo transparente separado en la mesa de prueba con una pantalla superior. A continuación, estimula la almohadilla del pie con el filamento Von Frey 3.61 que provoca cuatro gramos de fuerza.
Un retiro del pie de tres a cinco estímulos se considera una respuesta positiva. Ahora, aplica el siguiente filamento más débil de la serie hasta que el animal deje de responder a la estimulación mecánica. Utiliza el filamento superior hasta que se produzca una respuesta, y luego vuelve al filamento inferior.
Utilizando un algoritmo de ajuste de curvas, calcule el umbral de retirada mecánica, que es la cantidad mínima de fuerza necesaria para provocar una respuesta el 50% de las veces. Para realizar la prueba de Hargreaves, coloque a los ratones en cubículos sobre una superficie de vidrio calentada desde abajo por un emisor de infrarrojos. Mida el tiempo desde que se aplica el estímulo de luz infrarroja en la pata trasera del ratón hasta la retirada como latencia del pie.
Para la prueba de placa fría, coloque a los ratones en el aparato de placa fría enfriado a menos nueve grados centígrados. Registre el tiempo que tarda el ratón en levantar el pie después de ser colocado en el aparato como la latencia para retirar el pie. Para realizar la prueba de ansiedad, coloque a cada animal en la caja de prueba de preferencia de lugar con un pasillo entre dos cámaras.
Una cámara del aparato debe estar bien iluminada, mientras que el lado opuesto debe permanecer oscuro. Usando una computadora, monitoree los tiempos de ocupación y las transiciones de luz y oscuridad del animal durante una prueba de 10 minutos. A continuación, coloque los roedores modelo o los animales ingenuos en el laberinto cero, o utilice la prueba de preferencia de lugar claro u oscuro de dos cámaras.
Evalúe el tiempo que pasa en áreas cerradas y abiertas del laberinto usando un cronómetro. Para la prueba de depresión por salpicadura de sacarosa, rocíe una solución de sacarosa al 10 a 30% en el código dorsal y marque la frecuencia, la duración y la latencia del aseo durante 10 minutos. Para realizar pruebas de objetos novedosos, aclimate a los ratones individualmente a una jaula de plástico transparente con la parte superior abierta durante una hora.
Añade dos minifiguras de juguete idénticas en las esquinas opuestas de la jaula durante cinco minutos. Aclimatar a los animales el día de la prueba durante una hora y colocar las dos minifiguras idénticas en las mismas posiciones de la jaula durante cinco minutos antes de devolverlas a la jaula de origen. Luego, reemplace una de las figuras originales con un objeto novedoso claramente diferente.
Después de cuatro horas, devuelva los ratones a la jaula de prueba y registre el tiempo dedicado a explorar los objetos. Para la evaluación de la función motora, construya un túnel a partir de un tubo de toalla de papel cortado a lo largo en un borde. Extienda el túnel sobre una hoja de papel de impresora limpia.
Sostén a los ratones suavemente hasta que se calmen. Aplique tinta china no tóxica en las patas de un ratón colocándolas en un tintero, una almohadilla para sellos o con un hisopo de algodón. Suelta a los ratones en la entrada del túnel.
Permíteles correr por el túnel y capturarlos al final. Puntúa las huellas de las patas en función de la longitud de la zancada, la anchura de la zancada y la extensión de los dedos. Los ensayos de hipersensibilidad mecánica y térmica demostraron que los ratones con dolor de espalda crónico tenían una sensibilidad mecánica, al calor y al frío significativamente mayor en comparación con los controles ingenuos.
El análisis de la ansiedad mostró que el tiempo total pasado en la cámara de luz de la caja de luz y oscuridad y el número de eventos de cría fueron significativamente menores en ratones con dolor de espalda crónico, lo que indica ansiedad. Durante la prueba de salpicaduras de sacarosa, los ratones con dolor de espalda crónico mostraron un menor tiempo de acicalamiento y menor número de acicalamientos. Sin embargo, la cantidad de tiempo antes de que comience el aseo aumentó significativamente.
La longitud de la zancada entre los ratones con dolor de espalda crónico y los ratones ingenuos fue significativamente diferente. Lo más importante que debe recordar al intentar este procedimiento es que su objetivo son los ligamentos alrededor de la columna vertebral, no el músculo. El modelo de dolor de espalda crónico proporciona una herramienta confiable para evaluar una variedad de investigaciones novedosas, farmacológicas y otras terapias potenciales.
