H-рефлекс позволяет проводить электрофизиологическую проверку целостности нейронных цепей. Мы представляем терминальный протокол для количественной оценки H-рефлекса непосредственно на нервах передней лапы у мышей. В отличие от обычных, довольно нервно-неспецифических чрескожных записей, результаты менее варьируются между мышами и днями измерения.
Подобно записям Н-рефлекса у пациентов, точное количественное определение позволяет проводить электрофизиологические характеристики в моделях заболеваний, например, травмы спинного мозга и инсульта. Протокол требует солидных экспериментальных навыков работы с хирургическим оборудованием у мышей.
Если вы не знаете, как отделить нервы от соединительной ткани и кровеносных сосудов, сначала потренируйтесь. Продемонстрирует процедуру Фредерик Витерс, аспирант из моей лаборатории. Для начала поместите взрослую мышь C57 black/6J в возрасте от 8 до 16 недель на закрытую грелку и подождите, пока мышь не успокоится, дыхание не станет стабильным, а рефлексы отсутствуют.
Переверните мышь на спину. Затем зафиксируйте передние лапы скотчем. Расположите ленту так, чтобы измерительные электроды легко вставлялись в передние лапы.
Для измерения температуры мышью вставьте ректальный зонд и зафиксируйте его скотчем. Нанесите глазную мазь, чтобы предотвратить высыхание глаз. Аккуратно удалите мех тонкими закругленными ножницами, приподнимая кожу пинцетом.
Затем сделайте односантиметровый разрез на коже вдоль вентрозадней оси передней лапы парой тонких закругленных ножниц. Осторожно удалите соединительную ткань и обнажив нижнюю мышцу и нерв. Затем удалите обнаженную грудную мышцу с помощью щипцов для оценки срединного нерва.
Удалите небольшое количество крови и тканевой жидкости с помощью мягкой папиросной бумаги. Далее аккуратно разрежьте грудь или подмышечную мышцу сверху вниз, чтобы обнажить нервный пучок. Освободите нервный пучок от соединительной и мышечной ткани длиной примерно 1,5 сантиметра.
Аккуратно отделите локтевой и срединный нерв передней лапы с помощью изогнутой стеклянной пипетки. Верхний нерв - это локтевой нерв, а нижний - срединный нерв. Расположите электроды крючка стимулятора параллельно на расстоянии от 0,5 до одного миллиметра и с помощью микроманипулятора расположите двойной крючок близко к нерву.
Используйте стеклянный крючок, чтобы поднять локтевой нерв на электроды крючка для стимуляции. Затем оттяните электрод с нервом и отделите его от других нервов. Разместите электроды вдоль длинной оси лапы, чтобы уменьшить перекрестные помехи между мышцами.
Поверхностно высушите электродные крючки, прикрепленные к нерву, и нанесите вазелин с помощью шприца, чтобы обеспечить электрическую изоляцию от прилегающих тканей. Чтобы измерить Н-рефлекс, поместите электроды электромиографии внутримышечно в переднюю лапу. Затем поместите электрод сравнения подкожно в заднюю конечность, удерживаемый миниатюрным зажимом из кожи аллигатора.
Когда стимулятор включен, наблюдайте за успешной стимуляцией в виде крошечных подергиваний передней лапы. Минимальный ток стимуляции для вызова М-волны и крошечных видимых подергиваний в передней лапе составляет от 10 до 50 микроампер. Выполните стимуляцию нерва 15 раз импульсами продолжительностью 0,2 миллисекунды каждый.
С паузами в две минуты между наборами стимулов частоту увеличивают с 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 до 5 герц. Здесь показана иллюстрация записи, установленной в путях для измерения рефлекса Хоффмана и мышечной реакции. Оценивалось соотношение амплитуды Н- и М-волны.
Стимул и соответствующий артефакт стимуляции были установлены на ноль миллисекунд, за которыми следовала прямая М-волна и последующий меньший пик, представляющий Н-волну. М-волна возникает примерно через две миллисекунды после стимуляции, а Н-волна — через шесть-восемь миллисекунд из-за более длительного времени прохождения через спинной мозг. Помимо разделения нервов, решающее значение имеет нанесение вазелина на электрод, а также между двумя крючками.
Это окончательный эксперимент. В нашей лаборатории этот метод обеспечил новый золотой стандарт для чрескожных записей Н-рефлекса.
