Este método genera una huella dactilar de cardiolipina de leucocitos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF y permite la medición de la relación entre monolisocardiolipina y cardiolipina para un diagnóstico rápido del síndrome de Barth. La principal ventaja de esta técnica es la detección de especies lipídicas diagnósticas mediante una única ronda de espectrometría de masas inmediatamente después del aislamiento de leucocitos de un mililitro de sangre. Estos y la sensibilidad y especificidad ocular hacen de este ensayo una prueba diagnóstica adecuada para integrarse en el trabajo rutinario de los laboratorios clínicos para detectar el síndrome de Barth.
Comience colocando muestras de sangre en un agitador orbital durante 10 minutos. A continuación, a 0,9 mililitros de sangre total en un tubo de 1,5 mililitros, agregue 0,1 mililitros de dextrano al 20%. Ahora pipetee y disperse la suspensión suavemente 20 veces mientras evita las burbujas de aire y deje que los glóbulos rojos se sedimenten durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente.
Con una jeringa, recoja y transfiera el sobrenadante amarillo a un tubo de 15 mililitros y luego centrífuga a 400 veces G durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet que contiene principalmente leucocitos y glóbulos rojos residuales en 0,6 mililitros de agua doble destilada helada. Después de aproximadamente 15 segundos, agregue 0.2 mililitros de cloruro de potasio molar 0.6 a la suspensión celular para restaurar la osmolaridad correcta.
El choque osmótico corto lisará los glóbulos rojos y dejará intactos los leucocitos. Luego ajuste el volumen final a 2.5 mililitros con PBS de una sola fuerza. A continuación, centrífuga la suspensión a 400 veces G durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Esto es seguido por el descarte del sobrenadante y el relavado del pellet de leucocitos con 2,5 mililitros de PBS de una sola fuerza. Repita la centrífuga y deseche el sobrenadante como se describió anteriormente y vuelva a suspender el gránulo que contiene leucocitos en 200 microlitros de agua esterilizada doble destilada. Congele la suspensión a menos 80 grados centígrados o realice directamente la extracción de lípidos.
Comience la extracción transfiriendo 20 microlitros de suspensión de leucocitos a un tubo de 1,5 mililitros y gire a 16.000 veces G durante 30 segundos. Después de desechar el sobrenadante, agregue 10 microlitros de cloroformo al pellet restante y pipetee repetidamente para promover la extracción de lípidos. Ahora, agregue 10 microlitros de solución de matriz de 9-aminoacridina al pellet en cloroformo.
Pipetear y dispersar repetidamente para mezclar. Girar la solución que contiene lípidos y cloroformo y solución de matriz de 9-aminoacridina a 16, 000 veces G durante 30 segundos. Finalmente, deposite el sobrenadante como gotas de 0,35 microlitros en el objetivo MALDI para ser analizado y deje que las gotas se sequen al aire al menos durante 10 a 15 minutos.
Para el análisis de lípidos, adquiera espectros de masas de muestras en triplicados en un espectrómetro de masas MALDI-TOF. Después de la calibración con estándares de lípidos, configure los análisis en el modo de iones negativos y optimice el rango de relación masa-carga de detección de 200 thomson a 2, 000 thomson para el análisis de moléculas pequeñas. Mantenga la fluencia del láser un 5% por encima del umbral para tener una buena relación señal-ruido.
Para cada espectro de masas, aplique un promedio de 2. 000 disparos láser individuales. Adquirir espectro en modo reflector mediante extracción pulsada retardada. Aplique suspensión de matriz cerrada a 400 thomson para evitar la saturación del detector.
La figura muestra que los defectos en el gen TAFAZZIN típicamente determinan un perfil lipídico específico del síndrome de Barth indicado por la aparición de monolisocardiolipina y formas de cardiolipina inmadura junto con la reducción de las formas maduras de cardiolipina en la huella dactilar de cardiolipina. Además, la figura también muestra que los análisis MALDI-TOF / MS de leucocitos de sujetos de control generalmente exhiben solo dos especies de cardiolipina madura. La figura muestra que la monolisocardiolipina más cardiolipina inmadura en la proporción de cardiolipina madura para los pacientes con síndrome de Barth fue mayor que para los sujetos sanos y los pacientes con insuficiencia cardíaca.
Aquí, los grupos de control y los pacientes con síndrome de Barth están separados por más de un orden de magnitud, lo que demuestra que este método tiene una fuerte capacidad de diagnóstico para el síndrome de Barth. Para garantizar un buen resultado del ensayo, es crucial seguir cuidadosamente todos los pasos del protocolo, desde el aislamiento de los leucocitos hasta el cálculo de la relación monolisocardiolipina-cardiolipina. La espectrometría de masas MALDI-TOF es útil para obtener perfiles lipídicos de pequeñas cantidades de diversas muestras biológicas para identificar biomarcadores lipídicos o alteraciones patológicas.
