Este protocolo describe cómo diseñar uniones neuromusculares humanas 3D in vitro funcionales que se pueden usar para investigar patologías neuromusculares y probar posibles terapias. Esta técnica utiliza la estimulación optogenética simultánea y el procesamiento de video. Se cuantifican los cambios en la función de la unión neuromuscular durante el desarrollo y debido a factores externos, como las neurotoxinas y el suero de pacientes con miastenia gravis.
Los pasos que involucran la semilla de la célula muscular y la neurona motora en el biorreactor pueden ser desafiantes al principio. Mantener la mezcla de gel de colágeno en hielo puede ayudar a extender el tiempo disponible para sembrar todas las células antes de que el gel se solidifique. Comience mezclando una base de 10 a 1 con la mezcla de agente de curado de polidimetilsiloxano, o PDMS, y coloque la mezcla en una cámara de vacío.
Cierre todas las válvulas y encienda el vacío para desgasificar la mezcla durante al menos 30 minutos hasta que no queden burbujas de aire. Vierta la mezcla en moldes y desgasifique los moldes en la cámara de vacío durante 1 hora, luego cierre los moldes con la mitad superior del molde en la orientación correcta. Coloque una varilla de acero hexagonal sobre el centro y una abrazadera en ambos lados.
A continuación, vuelva a llenar la parte superior con PDMS y cure los moldes en un horno de 65 grados Celsius durante al menos 4 horas. Después de que los moldes se hayan enfriado a temperatura ambiente, retire las plataformas de los moldes. Mientras tanto, la cubierta de vidrio se desliza en poliol surfactante no iónico al 1% durante 30 minutos, asegurando que los resbalones de la cubierta no se apilan y estén todos debidamente recubiertos, luego enjuáguelos bien con agua destilada y séquelos durante la noche a 65 grados centígrados.
Trate los resbalones de la cubierta de vidrio y la plataforma PDMS utilizando un limpiador de plasma en alto con 6 litros por minuto de oxígeno durante 1 a 2 minutos. Una vez tratados, una los dos presionando el PDMS hacia abajo en el deslizamiento de la cubierta durante al menos 30 segundos. Prepare una mezcla de 4 a 1 de 3 miligramos por mililitro de colágeno 1 y matriz de membrana basal solubilizada, luego vuelva a suspender los mioblastos en esta mezcla de colágeno recién preparada.
A continuación, agregue 15 microlitros de esta suspensión de colágeno celular a cada cámara muscular del biorreactor, asegurándose de extender la suspensión a través de ambos pilares usando la punta de la pipeta. Permita que la mezcla de gel celular polimerice a 37 grados Celsius durante 30 minutos, luego llene cada pozo biorreactor con 450 microlitros de medios de crecimiento miotónico. En el día 11 de diferenciación de motoneuronas, transfiera las células y los medios a un tubo de 50 mililitros y permita que las neuroesferas se asienten en el fondo durante 5 minutos.
Aspirar el sobrenadante y resuspend las células en 15 mililitros de medio de cultivo en suspensión de motoneuronas suplementado con 20 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado del cerebro y 10 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado de células gliales. El día 14 de los protocolos de diferenciación, sembrar las motoneuronas en la plataforma. Prepare una mezcla de gel 4 a 1 de 2 miligramos por mililitro de colágeno 1 y matriz de membrana basal solubilizada.
Use un colador celular de 400 nanómetros para seleccionar neuroesferas grandes y resuspendírlas en la mezcla de gel preparada. Aspire cuidadosamente los medios del reservorio y la neuroesfera bien, luego agregue 15 microlitros de la mezcla de gel en el canal de la neuroesfera. Cargue una pipeta de 10 microlitros con 10 microlitros de gel y elija una neuroesfera.
Deposite la neuroesfera en el canal de la neuroesfera, asegurándose de que esté en la cámara, luego levante lentamente la pipeta mientras libera el gel restante una vez que se deposita la neuroesfera. Deje que el gel polimerice durante 30 minutos a 37 grados centígrados, luego agregue 450 microlitros de NbActiv4 complementados con 20 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado del cerebro y 10 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado de células gliales a los reservorios. Para la obtención de imágenes, utilice un microscopio fluorescente invertido con un software de cámara semiconductora de óxido metálico complementario científico.
Ajuste el Binning a 2 por 2, la exposición a 20 milisegundos, el obturador rodante encendido, la velocidad de lectura a 540 megahercios, el rango dinámico a 12 bits y la ganancia 1 y el modo de sensor a superposición. Utilice un objetivo 2x en el microscopio para obtener imágenes de los microtejidos y conecte una cámara de células vivas a la etapa del microscopio. Seleccione la región de interés que contiene los tejidos esqueléticos inervados para minimizar el tamaño del archivo y el tiempo de procesamiento, luego coloque un filtro de emisión de paso largo de 594 nanómetros entre la muestra y el objetivo de imagen para filtrar los pulsos de luz azul de la cámara.
A continuación, coloque una placa rectangular de 4 pocillos que contenga cuatro biorreactores en la cámara de células vivas, luego haga clic en vista en vivo y centre y enfoque la imagen con el ROI deseado. Descargue el código de macro personalizado de la carpeta github para controlar la posición del escenario, la placa Arduino y la adquisición de video, luego configure la película de salida como guión bajo de grupo de tejido de día subrayado de subrayado de tejido nombre de subrayado de tejido punto de experimento ND2. Ejecute el código de macro con las coordenadas X e Y deseadas establecidas en el escenario y adquiera un lapso de tiempo rápido con 1700 fotogramas a 50 fotogramas por segundo.
Después de la toma de imágenes, reemplace el medio y devuelva las muestras a la incubadora. Espere al menos 24 horas entre las sesiones de adquisición de imágenes para evitar la fatiga tisular. Para el procesamiento de películas, descargue los archivos de la carpeta GitHub y utilice el código personalizado de MATLAB para procesar los vídeos en el análisis por lotes.
Abra el script de análisis recursivo del sistema operativo para tener todos los videos adquiridos en la misma carpeta. Ajuste los parámetros previos al análisis y ejecute el script recursiveOSAnalysis para analizar las películas a través del procesamiento paralelo. Ajuste los parámetros posteriores al análisis, como el tiempo de referencia, el umbral máximo, la prominencia min-min y el ancho min-min según sea necesario.
Finalmente, genere salida de video y gráfico ejecutando recursiveOSMovie para generar un archivo de video para cada tejido con su respectivo rastro de contractilidad. Este protocolo se probó utilizando dos sistemas con diferentes escalas, un dispositivo microfluídico que produce tejidos musculares esqueléticos de 1 milímetro de largo que comprenden aproximadamente 20, 000 mioblastos y el sistema de biorreactor de pozo abierto que da como resultado tejidos musculares de 4 milímetros de largo que comprenden aproximadamente 450 mioblastos. Se construyó una configuración óptica para permitir la estimulación controlada de motoneuronas con luz azul y la función NMJ se elevó utilizando un macro script de microscopio personalizado emparejado con un código Arduino personalizado.
Este código incluye parámetros ajustables ajustables ajustables y determina si se desencadena una contracción en función del tiempo entre un pulso de luz y el inicio del pico de contractilidad. El sistema capturó una mejora de la función NMJ en los tejidos que muestran un aumento en las respuestas desencadenadas una semana después de la fabricación del tejido, seguida de una función estable durante una semana adicional. La alfa-bungarotoxina detuvo todas las contracciones desencadenadas y espontáneas, lo que resultó en una interrupción completa de la función de NMJ, lo que demuestra que la estimulación ligera de los tejidos requiere una NMJ funcional.
El análisis de los tejidos tratados con suero de miastenia gravis al 20% durante 48 horas mostró una disminución de la función en comparación con los tejidos de control tratados con suero de donantes sanos. 48 horas después de retirar y lavar el suero, los NMJ diseñados mostraron recuperación de la función. Asegúrese de que todos los biorreactores estén en el horno durante el mismo tiempo para evitar la variabilidad de rigidez entre lotes.
Además, asegúrese de verificar la siembra de neuronas motoras con el microscopio. Después de este procedimiento, se pueden realizar pruebas de detección metabalomáticas, proteómicas y CRISPR para recopilar información adicional y comprender mejor los cambios mecanicistas causados por el suero enfermo.
