Este protocolo se puede utilizar para obtener una mayor comprensión de la dinámica y el papel de las fosfoproteínas activas durante el desarrollo craneofacial de los mamíferos. Este protocolo supera la barrera común de la desfosforilación durante el aislamiento de proteínas de dos contextos fisiológicamente relevantes, los procesos faciales de ratón y las células de mesénquima palatal embrionarias de ratón cultivadas. Es imperativo moverse rápidamente mientras se mantienen todos los reactivos y materiales en hielo y usar inhibidores de la fosfatasa en todos los tampones de lisis para mantener la integridad de las proteínas fosforiladas.
Para comenzar, coloque el cuerpo del ratón en una tabla de disección con el lado ventral hacia arriba y rocíe el abdomen del ratón con etanol al 70%. Luego abra la cavidad abdominal pellizcando y levantando la piel anterior a la abertura vaginal con pinzas Semken rectas. A continuación, corte la piel levantada en las capas subyacentes con tijeras quirúrgicas de hoja recta en un ángulo de 45 grados a cada lado para generar una forma de V que se extienda a cada superficie lateral aproximadamente a medio camino entre las cuatro extremidades y las extremidades posteriores.
Usando las pinzas Semken, agarre uno de los cuernos uterinos y corte debajo del oviducto y por encima del cuello uterino con tijeras quirúrgicas. Para permitir la extirpación completa del cuerno uterino, corte el mesometrio, luego transfiera el cuerno uterino diseccionado a 10 mililitros de histología PBS en una placa de Petri de 10 centímetros. Del mismo modo, retire el segundo cuerno uterino en el lado opuesto de la cavidad abdominal.
Después, coloque la placa de Petri de 10 centímetros que contiene ambos cuernos uterinos sobre hielo. Bajo un microscopio estereoscópico de disección, diseccione cuidadosamente cada embrión de los cuernos uterinos con Dumont 5 fórceps finos. Luego retire lentamente el miometrio, la decidua y el corion.
A continuación, rasgue y elimine el amnios relativamente transparente que rodea al embrión y corte el cordón umbilical que conecta el embrión con la placenta. Luego transfiera cada embrión diseccionado a 2.5 mililitros de PBS histológico en un pozo individual de una placa de cultivo celular de 12 pocillos en hielo usando una pipeta de transferencia de plástico cortada. Preparar tres placas de Petri de 10 centímetros que contengan 10 mililitros de HISTOLOGÍA PBS y mantenerlas en hielo para ser utilizadas en rotación entre embriones.
Luego transfiera un embrión de un pozo individual de la placa de cultivo celular de 12 pocillos a una de las placas de Petri de 10 centímetros con PBS histológico en hielo utilizando una pipeta de transferencia de plástico cortado. Bajo el microscopio de disección, separe cada proceso maxilar de la cara usando los fórceps finos haciendo primero un corte en el lado anterior de un proceso maxilar a lo largo de la hendidura natural que separa el proceso nasal lateral en el proceso maxilar. A continuación, corte el lado posterior del proceso maxilar a lo largo de la hendidura natural que separa el proceso maxilar y el proceso mandibular.
Luego, separe completamente el proceso maxilar haciendo un corte vertical de los lados anterior a posterior del proceso maxilar en el lado del ojo del proceso maxilar donde terminan las hendiduras naturales a las que se hace referencia anteriormente. Usando una pipeta Pasteur de nueve pulgadas con un bulbo de látex pequeño de dos mililitros, transfiera el par diseccionado de procesos maxilares en una pequeña gota de aproximadamente 30 microlitros de HISTOLOGÍA PBS a una placa de Petri de 35 milímetros etiquetada en hielo. Luego transfiera el par de tejidos de proceso maxilar a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros marcado en hielo utilizando la pipeta Pasteur, minimizando la transferencia de PBS histológico.
Además, elimine cualquier exceso de PBS histológico en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con la pipeta Pasteur. Agregue 0.1 mililitro de tampón de lisis NP40 helado con inhibidores de proteasa y fosfatasa agregados inmediatamente antes de usarlos en hielo. Luego pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces con un PIPETMAN de 200 microlitros.
A continuación, vórtice durante 10 segundos, y luego pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces con un PIPETMAN de 200 microlitros, evitando la generación de burbujas. Incuba a cuatro grados centígrados durante dos horas mientras giras de extremo a extremo usando una paleta de 1,5 mililitros o dos mililitros con un revólver de tubo. Luego centrifugue las muestras a 13, 500 x g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius y recoja el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros en hielo con un PIPETMAN de 200 mililitros.
Primero, aspire el medio de las células del mesénquima palatino embrionario de ratón utilizando una pipeta Pasteur de 5,75 pulgadas unida a un sistema de vacío. Luego lave las células dos veces con PBS de cultivo de tejido helado y utilice la placa hacia un lado durante el último lavado para asegurarse de que todo el cultivo de tejido PBS se aspire. A continuación, agregue el tampón de lisis NP40 helado con inhibidores de proteasa y fosfatasa agregados inmediatamente antes de usarlos en hielo para lisar las células.
Incubar la placa en hielo durante cinco minutos con rotación aproximadamente cada minuto para garantizar una cobertura completa de la placa. Luego raspe las células de la placa usando un elevador de células preenfriado y transfiera la suspensión de la celda a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros preenfriado en hielo. Después, incuba la suspensión celular a cuatro grados centígrados durante 30 minutos mientras giras de extremo a extremo con una paleta de 1,5 mililitros o dos mililitros con un revólver de tubo.
Luego centrifugue las muestras a 13, 500 x g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius y recoja el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros en hielo con un PIPETMAN de 200 mililitros. El análisis de Western blot de lisados de células enteras de células embrionarias de ratón inmortalizadas en células del mesénquima palatal después de la estimulación con ligando PDFG-B de 2 a 15 minutos reveló distintas bandas reproducibles para las fosfoproteínas que se ejecutan a la altura o cerca de la altura de la banda de proteína total correspondiente. Se observó un aumento en las intensidades de la banda de fosfoproteínas en el tratamiento con un factor de crecimiento en comparación con las de las células no tratadas, mientras que las intensidades totales de la banda de proteínas fueron relativamente iguales entre las muestras.
Este protocolo se puede utilizar para sondear cómo las perturbaciones y la fosforilación influyen directamente en la señalización intercelular, la expresión génica y la actividad celular en contextos craneofaciales.
