Demostramos la miografía isométrica o tensométrica como el protocolo estándar de oro para medir la reactividad de pequeños vasos sanguíneos de resistencia o grandes conductos en una condición fisiológica bien controlada. Las mediciones son altamente reproducibles y fiables. La técnica es muy valiosa para permitir a los investigadores estudiar diferentes capas de vasos sanguíneos por separado o investigar la interacción entre diferentes capas de la pared del vaso sanguíneo simultáneamente.
Demostrando el procedimiento estará Robert Folk, el especialista del laboratorio de investigación de mi laboratorio. Comience por encender el baño de agua y ajustarlo a 37 grados centígrados. Coloque dos vasos de precipitados etiquetados apropiadamente en el baño de agua, uno con 600 mililitros de solución HEPES-PSS y otro con 150 mililitros de solución con alto contenido de potasio.
Airear un vaso de precipitados que contenga 300 mililitros de solución HEPES-PSS con gas carbógeno durante al menos 10 minutos. Agregue 30 mililitros de la solución aireada HEPES-PSS a un tubo de centrífuga de 50 mililitros, etiquételo adecuadamente y colóquelo en hielo. Mantenga la solución HEPES-PSS aireada restante en hielo para usarla durante el proceso de disección aórtica.
Encienda la unidad de miógrafo de cuatro cámaras a 5 mililitros de solución HEPES-PSS en cada cámara miográfica y ajuste el calor a 37 grados centígrados. Deje que la solución en cada cámara se airee durante 30 minutos y verifique que las cámaras hayan alcanzado los 37 grados centígrados deseados. Encienda el hardware y el ordenador de adquisición de datos del miógrafo.
Transfiera la caja torácica extirpada de los ratones sacrificados a una placa de Petri recubierta de elastómero de silicona transparente llena de tampón HEPES-PSS aireado helado y colóquela en ambos lados. Bajo el microscopio, corte y retire suavemente el corazón y la aorta adjunta de la caja torácica y transfiérala a un plato limpio recubierto de elastómero de silicona, luego retire suavemente el tejido conectivo graso y la sangre coagulada de la aorta. Usando tijeras pequeñas y afiladas, disecciona y aísla toda la aorta comenzando desde el área del arco hasta la parte inferior de la aorta descendente.
Corte la aorta disecada en cuatro segmentos de 2 milímetros cada uno. Use la mini-regla dentro del plato como referencia. En cámaras que ya contienen 5 mililitros de tampón HEPES-PSS calentado y aireado, deslice cuidadosamente cada uno de los segmentos aórticos de 2 milímetros sobre los dos pasadores de montaje con pinzas.
Al volver a colocar la cámara en la unidad de miógrafo, separe lentamente los pines girando el micrómetro en sentido contrario a las agujas del reloj para que el segmento aórtico no se deslice de los pines. Devuelva cada cámara miográfica a la unidad y comience a airear las cámaras a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Drene las cámaras y agregue 5 mililitros de solución HEPES-PSS fresca, tibia y aireada a cada cámara.
Si es necesario, reajuste las mediciones de fuerza para leer la tensión óptima de 6 milinewtons. Descanse el tejido durante otros 15 a 20 minutos. Abra el software de adquisición de datos.
Cambie los números de seguimiento de 50 a 1 a 500 a 1 y presione Inicio. Antes de comenzar un nuevo experimento, asegúrese de agregar la etiqueta adecuada en el software de adquisición de datos. Drene las cámaras una vez más antes de agregar 5 mililitros de solución con alto contenido de potasio a cada cámara.
Drene las cámaras nuevamente tan pronto como la respuesta contráctil a la solución con alto contenido de potasio alcance una meseta para la generación de fuerza. Lave el pañuelo con la solución HEPES-PSS tres veces. Agregue 5 mililitros de solución con alto contenido de potasio a cada cámara.
Drene las cámaras tan pronto como la respuesta contráctil a la solución con alto contenido de potasio alcance una meseta para la generación de fuerza y lave el tejido tres veces con HEPES-PSS, luego descanse el tejido durante 15 a 20 minutos. Precontraer los segmentos aórticos con el agente vasoconstrictor PE a una dosis submáxima. Permitir que la curva de contracción inducida por PE alcance una meseta para el desarrollo de la tensión.
Agregue una meseta de desarrollo de tensión a PE a 5 microlitros de dosis crecientes de soluciones de material de trabajo de acetilcolina en intervalos de 3 minutos para establecer concentraciones finales de acetilcolina de 50 picomolares a 10 micromolares en la cámara del miógrafo como se describe en el texto manuscrito. Después de completar el experimento de dosis-respuesta, drene las cámaras, lave los segmentos aórticos con solución HEPES-PSS tibia y aireada tres veces y descanse los tejidos durante 30 minutos. Después de descansar los segmentos aórticos durante 30 minutos, drene las cámaras y agregue una solución fresca y tibia con alto contenido de potasio a cada cámara, luego drene las cámaras y lave el tejido con la solución HEPES-PSS cuando la respuesta de contracción a la solución con alto contenido de potasio alcance una meseta F como se demostró anteriormente.
Pre-incubar los segmentos aórticos con L-NAME agregando 10 microlitros de la solución de material de trabajo preparada de 100 milimolares para evaluar la contribución de la producción de óxido nítrico a la vasorelajación inducida por acetilcolina observada. Sin quitar el nombre L, agregue la dosis submáxima de EP a la cámara para inducir la contracción aórtica. Espere hasta que la curva de contracción inducida por PE alcance una meseta para el desarrollo de la tensión, luego agregue acetilcolina a la cámara del miógrafo para lograr una concentración final de 500 nanomolares.
Espere unos minutos para registrar cualquier posible cambio en el desarrollo de la fuerza hasta que la meseta formada sea estable. Drene las cámaras y lave el pañuelo con una solución aireada tibia de HEPES-PSS tres veces. Coloque la cámara del miógrafo bajo el microscopio y pase suavemente un pequeño cable a través de la luz de la aorta.
Mueva suavemente el cable a través del lumen durante un período corto. Corte la aorta en anillos aórticos de 2 milímetros y monte esos anillos en la cámara miográfica. Ajuste la tensión óptima a 6 milinewtons y deje que el tejido descanse durante 30 minutos en tampón HEPES-PSS caliente aireado, luego drene las cámaras y agregue 5 mililitros de solución HEPES-PSS aireada caliente fresca a cada cámara.
Ponga a cero la fuerza para todas las cámaras del miógrafo y gire lentamente el micrómetro en sentido contrario a las agujas del reloj para aumentar la distancia entre los pines hasta que la fuerza registrada alcance la tensión óptima deseada para la aorta del ratón. Presione el tejido durante otros 15 a 20 minutos a la tensión óptima, luego drene las cámaras una vez más antes de agregar 5 mililitros de solución con alto contenido de potasio a cada cámara. Drene las cámaras nuevamente y lave el tejido con la solución HEPES-PSS tres veces una vez que la respuesta de contracción a la solución de iones con alto contenido de potasio alcance una meseta.
Descanse el tejido durante 15 a 20 minutos, luego precontraiga los segmentos aórticos con EP, el agente vasoconstrictor. Cuando la fuerza inducida por PE alcanza una meseta, agregue la concentración submáxima de acetilcolina a la cámara del miógrafo para lograr una concentración final de 500 nanomolares. Espere 3 minutos para asegurarse de que la meseta registrada para el desarrollo de la fuerza inducida por PE no cambie antes de finalizar el experimento.
La integridad y viabilidad de cada vaso aislado se evaluaron mediante el registro de la generación de fuerza contráctil. El pico de la fuerza registrada se utilizó más tarde para normalizar la generación de fuerza para el mismo segmento en respuesta a los agonistas. Las mediciones de vasorelajación mediadas por endotelio representaron la contracción mediada por el músculo liso y la generación de fuerza.
Cuando la contracción inducida por EP alcanzó una meseta, el aumento de las dosis de acetilcolina logró la máxima vasorelajación en el segmento aislado. El inhibidor del óxido nítrico L-NAME bloqueó completamente la vasorelajación inducida por la acetilcolina en la aorta precontraída, lo que indica que la acetilcolina induce la vasorelajación aórtica al aumentar la producción de óxido nítrico. Además, la eliminación de la capa endotelial de los segmentos aórticos también bloqueó la vasorelajación inducida por la acetilcolina, lo que subraya el papel del endotelio en la relajación de los vasos sanguíneos.
Asegúrese de ser suave al manipular, limpiar y diseccionar el vaso sanguíneo. Es fundamental agregar los agonistas e inhibidores farmacológicos con cuidado para no alterar los anillos de los vasos sanguíneos montados en las cámaras del miógrafo. La información puede ayudar a diseñar experimentos para explorar posibles enfoques terapéuticos para abordar la disfunción de las capas específicas de un vaso sanguíneo.
