אנו מדגימים את המיוגרפיה האיזומטרית או הטנסומטרית כפרוטוקול תקן הזהב למדידת תגובתיות של התנגדות קטנה או כלי דם צינוריים גדולים במצב פיזיולוגי מבוקר היטב. המדידות ניתנות לשחזור ואמינות מאוד. לטכניקה יש ערך רב בכך שהיא מאפשרת לחוקרים לחקור שכבות שונות של כלי דם בנפרד או לחקור אינטראקציה בין שכבות שונות של דופן כלי הדם בו זמנית.
מי שידגים את ההליך יהיה רוברט פולק, מומחה מעבדת המחקר מהמעבדה שלי. התחל על ידי הפעלת אמבט המים והגדרתו ל 37 מעלות צלזיוס. הכניסו לאמבט המים שתי כוסות המסומנות כראוי, אחת עם 600 מיליליטר של תמיסת HEPES-PSS ואחת עם 150 מיליליטר של תמיסת אשלגן גבוהה.
אוורר המכילה 300 מיליליטר של תמיסת HEPES-PSS עם גז קרבוגן למשך 10 דקות לפחות. הוסף 30 מיליליטר של תמיסת HEPES-PSS aerated לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר, תייג כראוי והנח אותו על קרח. שמור את תמיסת HEPES-PSS הנותרת על הקרח לשימוש במהלך תהליך הדיסקציה של אבי העורקים.
הפעל את יחידת המיוגרף בעלת ארבעת התאים ב-5 מיליליטר של תמיסת HEPES-PSS לכל תא מיוגרף והגדר את החום ל-37 מעלות צלזיוס. אפשרו לתמיסה בכל תא לאוורר במשך 30 דקות ובדקו שהתאים הגיעו ל-37 מעלות צלזיוס הרצויות. הפעל את החומרה והמחשב לאיסוף נתוני מיוגרף.
מעבירים את כלוב בית החזה שנכרת מהעכברים שהומתו לצלחת פטרי שקופה מצופה אלסטומר מסיליקון מלאה בחיץ HEPES-PSS קר כקרח והצמידו אותו משני הצדדים. מתחת למיקרוסקופ, חותכים ומסירים בעדינות את הלב ואת אבי העורקים המחובר מכלוב הצלעות ומעבירים לצלחת נקייה מצופה אלסטומר מסיליקון, ואז מסירים בעדינות רקמת חיבור שומן ודם קרוש מאבי העורקים. בעזרת מספריים קטנים וחדים, מנתחים ומבודדים את כל אבי העורקים החל מאזור הקשת ועד לתחתית אבי העורקים היורד.
חותכים את אבי העורקים המנותק לארבעה מקטעים של 2 מילימטרים כל אחד. השתמש בסרגל הקטן בתוך המנה כהפניה. בתאים שכבר מכילים 5 מיליליטר של חיץ HEPES-PSS מחומם ומאוורר, החליקו בזהירות כל אחד מקטעי אבי העורקים בקוטר 2 מילימטרים על שני פיני ההרכבה באמצעות מלקחיים.
בעת הנחת התא בחזרה ביחידת המיוגרף, הזיזו באיטיות את הפינים זה מזה על ידי סיבוב המיקרומטר נגד כיוון השעון כך שמקטע אבי העורקים לא יחליק מהפינים. החזירו כל תא מיוגרף ליחידה והתחילו לאוורר את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. מסננים את התאים ומוסיפים 5 מיליליטר של תמיסת HEPES-PSS טרייה, חמה ומאווררת לכל תא.
במידת הצורך, התאימו מחדש את מדידות הכוח כדי לקרוא את המתח האופטימלי של 6 מילי-ניוטון. לנוח את הרקמה עוד 15 עד 20 דקות. פתח את התוכנה לאיסוף נתונים.
שנה את מספרי המעקב מ- 50 ל- 1 ל- 500 ל- 1 ולחץ על התחל. לפני תחילת ניסוי חדש, הקפד להוסיף את התווית המתאימה על תוכנת רכישת הנתונים. מסננים את התאים פעם נוספת לפני שמוסיפים 5 מיליליטר של תמיסה עשירה באשלגן לכל תא.
מסננים את התאים שוב ברגע שהתגובה המתכווצת לתמיסת האשלגן הגבוהה מגיעה לרמה ליצירת כוח. לשטוף את הרקמה עם תמיסת HEPES-PSS שלוש פעמים. הוסף 5 מיליליטר של תמיסת אשלגן גבוהה לכל תא.
מסננים את התאים ברגע שהתגובה המתכווצת לתמיסת אשלגן גבוהה מגיעה לרמה ליצירת כוח ושוטפים את הרקמה שלוש פעמים עם HEPES-PSS, ואז מניחים את הרקמה למשך 15 עד 20 דקות. התכווצו מראש של מקטעי אבי העורקים עם סוכן vasoconstrictor PE במינון תת-מקסימלי. אפשר לעקומת הכיווץ המושרה על ידי PE להגיע לרמה להתפתחות מתח.
הוסף רמה של פיתוח מתח ל- PE ב 5 מיקרוליטרים של מינונים הולכים וגדלים של תמיסות מלאי עבודה של אצטילכולין במרווחים של 3 דקות כדי לקבוע ריכוזים סופיים של אצטילכולין מ 50 picomolar ל 10 micromolar בתא מיוגרף כפי שמתואר בכתב היד טקסט. לאחר השלמת ניסוי תגובת המינון, יש לנקז את התאים, לשטוף את מקטעי אבי העורקים בתמיסת HEPES-PSS חמה ואוורירית שלוש פעמים ולנוח את הרקמות למשך 30 דקות. לאחר מנוחה של מקטעי אבי העורקים במשך 30 דקות, מסננים את התאים ומוסיפים תמיסת אשלגן גבוהה טרייה וחמה לכל תא, ולאחר מכן מסננים את התאים ושוטפים את הרקמה בתמיסת HEPES-PSS כאשר תגובת ההתכווצות לתמיסת אשלגן גבוהה מגיעה לרמת F כפי שהודגם קודם לכן.
הדגירה מראש של מקטעי אבי העורקים עם L-NAME על ידי הוספת 10 מיקרוליטרים של תמיסת מלאי העבודה המוכנה של 100 מילימולאר כדי להעריך את התרומה של ייצור תחמוצת החנקן לווזורגנציה הנגרמת על ידי אצטילכולין. מבלי להסיר את השם L, הוסף את המינון התת-מקסימלי של PE לתא כדי לגרום להתכווצות אבי העורקים. המתן עד שעקומת הכיווץ המושרה על ידי PE תגיע לרמה להתפתחות מתח, ולאחר מכן הוסף אצטילכולין לתא המיוגרף כדי להשיג ריכוז סופי של 500 ננו-מולר.
המתן מספר דקות כדי לרשום כל שינוי אפשרי בפיתוח הכוח עד שהרמה שנוצרה תהיה יציבה. מסננים את התאים ושוטפים את הרקמה בתמיסת HEPES-PSS חמה שלוש פעמים. מקם את תא המיוגרף מתחת למיקרוסקופ והעביר בעדינות חוט קטן דרך לומן של אבי העורקים.
בעדינות להעביר את החוט דרך לומן לתקופה קצרה. חותכים את אבי העורקים לטבעות אבי העורקים בקוטר 2 מילימטרים ומרכיבים טבעות אלה על תא המיוגרף. הגדר את המתח האופטימלי על 6 מיליניוטון ואפשר לרקמה לנוח במשך 30 דקות בחיץ HEPES-PSS חם ואוורירי, ולאחר מכן לנקז את התאים ולהוסיף 5 מיליליטר של תמיסת HEPES-PSS חמה ורעננה לכל תא.
אפס את הכוח עבור כל תאי המיוגרף וסובב באיטיות את המיקרומטר נגד כיוון השעון כדי להגדיל את המרחק בין הפינים עד שהכוח הרשום מגיע למתח האופטימלי הרצוי עבור אבי העורקים של העכבר. לחץ על הרקמה במשך 15 עד 20 דקות נוספות במתח האופטימלי, ולאחר מכן לנקז את התאים פעם נוספת לפני הוספת 5 מיליליטר של תמיסה אשלגן גבוהה לכל תא. מסננים שוב את התאים ושוטפים את הרקמה בתמיסת HEPES-PSS שלוש פעמים לאחר שתגובת ההתכווצות לתמיסת היונים עתירת האשלגן מגיעה למישור.
לנוח את הרקמה במשך 15 עד 20 דקות, ולאחר מכן מראש חוזה את קטעי אבי העורקים עם PE, סוכן vasoconstrictor. כאשר הכוח המושרה על ידי PE מגיע לרמה, הוסף את הריכוז התת-מקסימלי של אצטילכולין לתא המיוגרף כדי להשיג ריכוז סופי של 500 ננו-מולר. המתן 3 דקות כדי לוודא שהרמה הרשומה לפיתוח כוח המושרה על-ידי PE אינה משתנה לפני סיום הניסוי.
שלמותו וכדאיותו של כל כלי שיט מבודד הוערכו על ידי רישום ייצור הכוח המתכווץ. שיא הכוח המוקלט שימש מאוחר יותר כדי לנרמל את ייצור הכוח לאותו קטע בתגובה לאגוניסטים. מדידות כלי הדם בתיווך האנדותל תיארו כיווץ בתיווך שרירים חלקים ויצירת כוח.
כאשר ההתכווצות המושרה על ידי PE הגיעה לרמה, מינונים הולכים וגדלים של אצטילכולין השיגו את vasorelaxation מקסימלית במגזר מבודד. מעכב תחמוצת החנקן L-NAME חסם לחלוטין את כלי הדם המושרה על ידי אצטילכולין באבי העורקים שנדבק מראש, מה שמצביע על כך שאצטילכולין משרה את כלי הדם של אבי העורקים באמצעות הגדלת ייצור תחמוצת החנקן. יתר על כן, הסרת שכבת האנדותל ממקטעי אבי העורקים גם חסמה את כלי הדם הנגרמים על ידי אצטילכולין ומדגישה את תפקיד האנדותל בהרפיית כלי הדם.
הקפידו להיות עדינים בזמן הטיפול, הניקוי והניתוח של כלי הדם. חשוב להוסיף את האגוניסטים והמעכבים הפרמקולוגיים בזהירות כדי לא להפריע לטבעות כלי הדם המותקנות על תאי המיוגרף. המידע יכול לסייע בתכנון ניסויים כדי לחקור גישות טיפוליות פוטנציאליות לטיפול בתפקוד לקוי של שכבות כלי דם מסוים.
