İzometrik veya tensometrik miyografiyi, iyi kontrol edilen bir fizyolojik durumda küçük direncin veya büyük kanal kan damarlarının reaktivitesini ölçmek için altın standart protokol olarak gösteriyoruz. Ölçümler son derece tekrarlanabilir ve güvenilirdir. Bu teknik, araştırmacıların farklı kan damarı katmanlarını ayrı ayrı incelemelerine veya kan damarı duvarının farklı katmanları arasındaki etkileşimi aynı anda araştırmalarına izin vermede çok değerlidir.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan araştırma laboratuvarı uzmanı Robert Folk olacak. Su banyosunu açıp 37 santigrat dereceye ayarlayarak başlayın. Su banyosuna uygun şekilde etiketlenmiş iki beheri yerleştirin, biri 600 mililitre HEPES-PSS çözeltisi ve diğeri 150 mililitre yüksek potasyum çözeltisi ile.
300 mililitre HEPES-PSS çözeltisi içeren bir beheri en az 10 dakika boyunca karbojen gazı ile havalandırın. 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 30 mililitre havalandırılmış HEPES-PSS çözeltisi ekleyin, uygun şekilde etiketleyin ve buzun üzerine yerleştirin. Kalan havalandırılmış HEPES-PSS solüsyonunu aort diseksiyonu işlemi sırasında kullanılmak üzere buz üzerinde tutun.
Dört odacıklı miyograf ünitesini her miyograf odasına 5 mililitre HEPES-PSS çözeltisinde açın ve ısıyı 37 santigrat dereceye ayarlayın. Her odadaki çözeltinin 30 dakika boyunca havalandırılmasına izin verin ve odaların istenen 37 santigrat dereceye ulaştığından emin olmak için kontrol edin. Miyograf veri toplama donanımını ve bilgisayarını açın.
Ötanize edilmiş farelerden eksize edilen torasik kafesi, buz gibi soğuk havalandırılmış HEPES-PSS tamponu ile doldurulmuş şeffaf silikon elastomer kaplı Petri kabına aktarın ve her iki tarafa da sabitleyin. Mikroskop altında, kalbi ve bağlı aortu göğüs kafesinden yavaşça kesin ve çıkarın ve temiz bir silikon elastomer kaplı kaba aktarın, ardından yağ bağ dokusunu ve pıhtılaşmış kanı aorttan yavaşça çıkarın. Keskin küçük makaslar kullanarak, tüm aortu ark bölgesinden başlayarak inen aortun dibine kadar diseke edin ve izole edin.
Disseke edilmiş aortu her biri 2 milimetrelik dört segmente bölün. Çanak içindeki mini cetveli referans olarak kullanın. Zaten 5 mililitre ısıtılmış ve havalandırılmış HEPES-PSS tamponu içeren odalarda, forseps kullanarak 2 milimetrelik aort segmentlerinin her birini iki montaj pimine dikkatlice kaydırın.
Odayı miyograf ünitesine geri yerleştirirken, mikrometreyi saat yönünün tersine döndürerek pimleri yavaşça birbirinden ayırın, böylece aort segmenti pimlerden kaymaz. Her miyograf odasını üniteye geri döndürün ve odaları 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede havalandırmaya başlayın. Odaları boşaltın ve her odaya 5 mililitre taze, ılık, havalandırılmış HEPES-PSS çözeltisi ekleyin.
Gerekirse, 6 milinewtonluk optimum gerilimi okumak için kuvvet ölçümlerini yeniden ayarlayın. Dokuyu 15 ila 20 dakika daha dinlendirin. Veri toplama yazılımını açın.
Takip numaralarını 50'den 1'e, 500'den 1'e değiştirin ve Başlat'a basın. Yeni bir denemeye başlamadan önce, veri toplama yazılımına uygun etiketi eklediğinizden emin olun. Her odaya 5 mililitre yüksek potasyum çözeltisi eklemeden önce odaları bir kez daha boşaltın.
Yüksek potasyum çözeltisine kontraktil tepki kuvvet üretimi için bir platoya ulaşır ulaşmaz odaları tekrar boşaltın. Dokuyu HEPES-PSS çözeltisi ile üç kez yıkayın. Her odaya 5 mililitre yüksek potasyum çözeltisi ekleyin.
Yüksek potasyum çözeltisine kontraktil yanıt kuvvet üretimi için bir platoya ulaşır ulaşmaz odaları boşaltın ve dokuyu HEPES-PSS ile üç kez yıkayın, ardından dokuyu 15 ila 20 dakika dinlendirin. Aort segmentlerini vazokonstriktör ajan PE ile maksimuma yakın bir dozda önceden büzüştürün. PE kaynaklı kasılma eğrisinin gerilim gelişimi için bir platoya ulaşmasına izin verin.
Metin makalesinde açıklandığı gibi miyograf odasında 50 pikomolar ila 10 mikromolar arasında son asetilkolin konsantrasyonlarını oluşturmak için 3 dakikalık aralıklarla 5 mikrolitre artan dozda asetilkolin çalışma stok solüsyonlarında PE'ye bir gerilim gelişim platosu ekleyin. Doz yanıtı deneyini tamamladıktan sonra, odaları boşaltın, aort segmentlerini ılık ve havalandırılmış HEPES-PSS çözeltisi ile üç kez yıkayın ve dokuları 30 dakika dinlendirin. Aort segmentlerini 30 dakika dinlendirdikten sonra, odaları boşaltın ve her odaya taze, ılık yüksek potasyumlu çözelti ekleyin, daha sonra odaları boşaltın ve yüksek potasyumlu çözeltiye kasılma tepkisi daha önce gösterildiği gibi bir F platosuna ulaştığında dokuyu HEPES-PSS çözeltisi ile yıkayın.
Nitrik oksit üretiminin gözlenen asetilkolin kaynaklı vazogevşemeye katkısını değerlendirmek için hazırlanan 100 milimolar çalışma stoğu çözeltisinin 10 mikrolitresini ekleyerek aort segmentlerini L-NAME ile önceden inkübe edin. L adını çıkarmadan, aort kasılmasını indüklemek için odaya alt maksimum PE dozu ekleyin. PE kaynaklı kasılma eğrisi gerilim gelişimi için bir platoya ulaşana kadar bekleyin, ardından 500 nanomolar'lık son bir konsantrasyon elde etmek için miyograf odasına asetilkolin ekleyin.
Oluşan plato stabil olana kadar kuvvet gelişimindeki olası değişiklikleri kaydetmek için birkaç dakika bekleyin. Odaları boşaltın ve dokuyu üç kez ılık havalandırılmış HEPES-PSS çözeltisi ile yıkayın. Miyograf odasını mikroskop altına yerleştirin ve aortun lümeninden küçük bir teli yavaşça geçirin.
Teli kısa bir süre için lümenden yavaşça hareket ettirin. Aortu 2 milimetrelik aort halkalarına kesin ve bu halkaları miyograf odasına monte edin. Optimum gerilimi 6 milinewtona ayarlayın ve dokunun havalandırılmış sıcak HEPES-PSS tamponunda 30 dakika dinlenmesine izin verin, ardından odaları boşaltın ve her odaya 5 mililitre taze sıcak havalandırılmış HEPES-PSS çözeltisi ekleyin.
Tüm miyograf odaları için kuvveti sıfırlayın ve kaydedilen kuvvet fare aortu için istenen optimum gerilime ulaşana kadar pimler arasındaki mesafeyi artırmak için mikrometreyi saat yönünün tersine yavaşça döndürün. Dokuyu optimum gerilimde 15 ila 20 dakika daha bastırın, ardından her odaya 5 mililitre yüksek potasyumlu çözelti eklemeden önce odaları bir kez daha boşaltın. Odaları tekrar boşaltın ve yüksek potasyum iyon çözeltisine kasılma tepkisi bir platoya ulaştığında dokuyu HEPES-PSS çözeltisi ile üç kez yıkayın.
Dokuyu 15 ila 20 dakika dinlendirin, ardından aort segmentlerini vazokonstriktör ajan PE ile önceden kasılın. PE kaynaklı kuvvet bir platoya ulaştığında, 500 nanomolar'lık bir nihai konsantrasyon elde etmek için miyograf odasına maksimum asetilkolin konsantrasyonunu ekleyin. Deneyi sonlandırmadan önce PE kaynaklı kuvvet gelişimi için kayıtlı platonun değişmediğinden emin olmak için 3 dakika bekleyin.
İzole edilen her bir kabın bütünlüğü ve yaşayabilirliği, kasılma kuvveti üretimi kaydedilerek değerlendirildi. Kaydedilen kuvvetin zirvesi daha sonra agonistlere yanıt olarak aynı segment için kuvvet üretimini normalleştirmek için kullanıldı. Endotel aracılı vazogevşeme ölçümlerinde düz kas aracılı kasılma ve kuvvet oluşumu saptandı.
PE kaynaklı kontraksiyon bir platoya ulaştığında, artan asetilkolin dozları, izole segmentte maksimum vazogevşemeye ulaştı. Nitrik oksit inhibitörü L-NAME, önceden kontrakte edilmiş aorttaki asetilkolin kaynaklı vazoresyonu tamamen bloke etti, asetilkolinin nitrik oksit üretimini artırarak aort vazoredüklesyonunu indüklediğini gösterdi. Ayrıca, endotel tabakasının aort segmentlerinden çıkarılması, endotelin kan damarı gevşemesindeki rolünü vurgulayan asetilkolin kaynaklı vazogevşemeyi de bloke etti.
Kan damarını tutarken, temizlerken ve parçalara ayırırken nazik olduğunuzdan emin olun. Farmakolojik agonistleri ve inhibitörleri, miyograf odalarına monte edilen kan damarı halkalarını rahatsız etmemek için dikkatle eklemek çok önemlidir. Bilgiler, belirli bir kan damarının katmanlarının işlev bozukluğunu ele almak için potansiyel terapötik yaklaşımları keşfetmek için deneylerin tasarlanmasına yardımcı olabilir.
