Nous démontrons la myographie isométrique ou tensométrique comme protocole de référence pour mesurer la réactivité des petits vaisseaux sanguins de résistance ou de grands conduits dans un état physiologique bien contrôlé. Les mesures sont hautement reproductibles et fiables. La technique est très utile pour permettre aux chercheurs d’étudier différentes couches de vaisseaux sanguins séparément ou d’étudier simultanément l’interaction entre différentes couches de la paroi des vaisseaux sanguins.
Robert Folk, le spécialiste du laboratoire de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par allumer le bain-marie et réglez-le à 37 degrés Celsius. Placez deux béchers étiquetés de manière appropriée dans le bain-marie, l’un avec 600 millilitres de solution HEPES-PSS et l’autre avec 150 millilitres de solution riche en potassium.
Aérer un bécher contenant 300 millilitres de solution HEPES-PSS avec du gaz carbogène pendant au moins 10 minutes. Ajouter 30 millilitres de la solution HEPES-PSS aérée à un tube centrifuge de 50 millilitres, étiqueter de manière appropriée et le placer sur de la glace. Conserver le reste de la solution HEPES-PSS aérée sur de la glace pour l’utiliser pendant le processus de dissection aortique.
Allumez l’unité myographique à quatre chambres à 5 millilitres de solution HEPES-PSS dans chaque chambre myographique et réglez la chaleur à 37 degrés Celsius. Laisser la solution dans chaque chambre être aérée pendant 30 minutes et vérifier que les chambres ont atteint les 37 degrés Celsius souhaités. Allumez le matériel d’acquisition de données myographiques et l’ordinateur.
Transférer la cage thoracique excisée des souris euthanasiées dans une boîte de Petri transparente recouverte d’élastomère de silicone remplie d’un tampon HEPES-PSS aéré glacé et l’épingler des deux côtés. Au microscope, coupez et retirez doucement le cœur et l’aorte attachée de la cage thoracique et transférez-les dans une boîte propre recouverte d’élastomère de silicone, puis retirez doucement le tissu conjonctif adipeux et le sang coagulé de l’aorte. À l’aide de petits ciseaux tranchants, disséquez et isolez toute l’aorte en partant de la zone de la voûte jusqu’au bas de l’aorte descendante.
Couper l’aorte disséquée en quatre segments de 2 millimètres chacun. Utilisez la mini-règle dans le plat comme référence. Dans les chambres contenant déjà 5 millilitres de tampon HEPES-PSS chauffé et aéré, faites glisser délicatement chacun des segments aortiques de 2 millimètres sur les deux broches de montage à l’aide d’une pince.
Lorsque vous replacez la chambre dans l’unité myographique, écartez lentement les broches en tournant le micromètre dans le sens inverse des aiguilles d’une montre afin que le segment aortique ne glisse pas des broches. Remettez chaque chambre myographique dans l’unité et commencez à aérer les chambres à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Vidangez les chambres et ajoutez 5 millilitres de solution HEPES-PSS fraîche, chaude et aérée à chaque chambre.
Si nécessaire, réajuster les mesures de force pour lire la tension optimale de 6 millinewtons. Reposez le tissu pendant encore 15 à 20 minutes. Ouvrez le logiciel d’acquisition de données.
Modifiez les numéros de suivi de 50 à 1 à 500 à 1 et appuyez sur Démarrer. Avant de commencer une nouvelle expérience, assurez-vous d’ajouter l’étiquette appropriée sur le logiciel d’acquisition de données. Vidangez les chambres une fois de plus avant d’ajouter 5 millilitres de solution riche en potassium dans chaque chambre.
Vidangez à nouveau les chambres dès que la réponse contractile à la solution riche en potassium atteint un plateau pour la génération de force. Laver le tissu avec la solution HEPES-PSS trois fois. Ajouter 5 millilitres de solution riche en potassium dans chaque chambre.
Vidangez les chambres dès que la réponse contractile à une solution riche en potassium atteint un plateau pour la génération de force et lavez le tissu trois fois avec HEPES-PSS, puis reposez le tissu pendant 15 à 20 minutes. Pré-contracter les segments aortiques avec l’agent vasoconstricteur PE à une dose inférieure à la dose maximale. Laissez la courbe de contraction induite par le PE atteindre un plateau pour le développement de la tension.
Ajouter un plateau de développement de tension à l’EP à 5 microlitres de doses croissantes de solutions de base d’acétylcholine à intervalles de 3 minutes pour établir les concentrations finales d’acétylcholine de 50 picomolaires à 10 micromolaires dans la chambre myographique comme décrit dans le manuscrit texte. Après avoir terminé l’expérience dose-réponse, vider les chambres, laver les segments aortiques avec une solution HEPES-PSS tiède et aérée trois fois et reposer les tissus pendant 30 minutes. Après avoir laissé reposer les segments aortiques pendant 30 minutes, égoutter les chambres et ajouter une solution fraîche et chaude à haute teneur en potassium dans chaque chambre, puis égoutter les chambres et laver les tissus avec la solution HEPES-PSS lorsque la réponse de contraction à la solution riche en potassium atteint un plateau F comme démontré précédemment.
Pré-incuber les segments aortiques avec L-NAME en ajoutant 10 microlitres de la solution de base préparée de 100 millimolaires pour évaluer la contribution de la production d’oxyde nitrique à la vasorelaxation induite par l’acétylcholine observée. Sans enlever le nom L, ajouter la dose sous-maximale de PE dans la chambre pour induire la contraction aortique. Attendez que la courbe de contraction induite par l’EP atteigne un plateau pour le développement de la tension, puis ajoutez de l’acétylcholine à la chambre myographique pour atteindre une concentration finale de 500 nanomolaires.
Attendez quelques minutes pour enregistrer tout changement possible dans le développement de la force jusqu’à ce que le plateau formé soit stable. Égoutter les chambres et laver les tissus avec une solution chaude aérée HEPES-PSS trois fois. Placez la chambre myographique sous le microscope et passez doucement un petit fil à travers la lumière de l’aorte.
Déplacez doucement le fil à travers la lumière pendant une courte période. Coupez l’aorte en anneaux aortiques de 2 millimètres et montez ces anneaux sur la chambre myographique. Réglez la tension optimale à 6 millinewtons et laissez reposer le tissu pendant 30 minutes dans un tampon HEPES-PSS chaud aéré, puis vidangez les chambres et ajoutez 5 millilitres de solution HEPES-PSS chaude et chaude aérée à chaque chambre.
Mettez à zéro la force de toutes les chambres myographiques et faites tourner lentement le micromètre dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour augmenter la distance entre les broches jusqu’à ce que la force enregistrée atteigne la tension optimale souhaitée pour l’aorte de la souris. Pressez le mouchoir pendant encore 15 à 20 minutes à la tension optimale, puis vidangez à nouveau les chambres avant d’ajouter 5 millilitres de solution riche en potassium dans chaque chambre. Vidangez à nouveau les chambres et lavez les tissus avec la solution HEPES-PSS trois fois une fois que la réponse de contraction à la solution d’ions riches en potassium atteint un plateau.
Reposer le tissu pendant 15 à 20 minutes, puis pré-contracter les segments aortiques avec PE, l’agent vasoconstricteur. Lorsque la force induite par l’EP atteint un plateau, ajoutez la concentration inférieure maximale d’acétylcholine à la chambre myographique pour obtenir une concentration finale de 500 nanomolaires. Attendez 3 minutes pour vous assurer que le plateau enregistré pour le développement de la force induite par l’EP ne change pas avant de terminer l’expérience.
L’intégrité et la viabilité de chaque navire isolé ont été évaluées en enregistrant la génération de force contractile. Le pic de la force enregistrée a ensuite été utilisé pour normaliser la génération de force pour le même segment en réponse aux agonistes. Les mesures de vasorelaxation médiée par l’endothélium ont représenté la contraction médiée par les muscles lisses et la génération de force.
Lorsque la contraction induite par l’EP a atteint un plateau, des doses croissantes d’acétylcholine ont atteint la vasorelaxation maximale dans le segment isolé. L’inhibiteur d’oxyde nitrique L-NAME a complètement bloqué la vasorelaxation induite par l’acétylcholine dans l’aorte pré-contractée, indiquant que l’acétylcholine induit une vasorelaxation aortique en augmentant la production d’oxyde nitrique. De plus, l’élimination de la couche endothéliale des segments aortiques a également bloqué la vasorelaxation induite par l’acétylcholine, soulignant le rôle de l’endothélium dans la relaxation des vaisseaux sanguins.
Assurez-vous d’être doux lors de la manipulation, du nettoyage et de la dissection du vaisseau sanguin. Il est essentiel d’ajouter les agonistes pharmacologiques et les inhibiteurs avec soin pour ne pas perturber les anneaux de vaisseaux sanguins montés sur les chambres myographiques. L’information peut aider à concevoir des expériences pour explorer des approches thérapeutiques potentielles pour traiter le dysfonctionnement des couches d’un vaisseau sanguin spécifique.
