Мы демонстрируем изометрическую или тензометрическую миографию в качестве протокола золотого стандарта для измерения реакционной способности малых или крупных кровеносных сосудов в хорошо контролируемом физиологическом состоянии. Измерения отличаются высокой воспроизводимостью и надежностью. Этот метод очень ценен тем, что позволяет исследователям изучать различные слои кровеносных сосудов отдельно или исследовать взаимодействие между различными слоями стенки кровеносного сосуда одновременно.
Демонстрировать процедуру будет Роберт Фолк, специалист исследовательской лаборатории из моей лаборатории. Начните с включения водяной бани и установки ее на 37 градусов по Цельсию. Поместите на водяную баню два стакана, помеченных соответствующим образом, один с 600 миллилитрами раствора HEPES-PSS и один со 150 миллилитрами раствора с высоким содержанием калия.
Аэрировать стакан, содержащий 300 миллилитров раствора HEPES-PSS с газообразным карбогеном, в течение не менее 10 минут. Добавьте 30 миллилитров аэрированного раствора HEPES-PSS в 50-миллилитровую центрифужную трубку, метьте соответствующим образом и поместите его на лед. Держите оставшийся аэрированный раствор HEPES-PSS на льду для использования в процессе расслоения аорты.
Включите четырехкамерный блок миографа на 5 миллилитров раствора HEPES-PSS в каждую камеру миографа и установите температуру до 37 градусов Цельсия. Дайте раствору в каждой камере аэрироваться в течение 30 минут и проверьте, чтобы камеры достигли желаемых 37 градусов по Цельсию. Включите аппаратное обеспечение и компьютер для сбора данных миографа.
Переместите грудную клетку, иссеченную от усыпленных мышей, в прозрачную силиконовую чашку Петри, покрытую ледяным холодным газированным буфером HEPES-PSS, и закрепите ее с обеих сторон. Под микроскопом аккуратно вырежьте и удалите сердце и прикрепленную аорту из грудной клетки и перенесите в чистую силиконовую посуду, покрытую эластомером, затем аккуратно удалите жировую соединительную ткань и свернувшуюся кровь из аорты. С помощью острых мелких ножниц рассекните и изолируйте всю аорту, начиная от области дуги до дна нисходящей аорты.
Разрезать рассеченную аорту на четыре сегмента по 2 миллиметра каждый. Используйте мини-линейку внутри блюда в качестве ориентира. В камерах, уже содержащих 5 миллилитров нагретого и аэрированного буфера HEPES-PSS, осторожно сдвиньте каждый из 2-миллиметровых сегментов аорты на два крепежных штифта с помощью щипцов.
При размещении камеры обратно в блок миографа медленно размещайте штифты, вращая микрометр против часовой стрелки, чтобы сегмент аорты не соскальзывал со штифтов. Верните каждую камеру миографа в блок и начните аэрировать камеры при 37 градусах Цельсия в течение 20 минут. Процедите камеры и добавьте в каждую камеру по 5 миллилитров свежего, теплого, газированного раствора HEPES-PSS.
При необходимости перенастройте измерения силы, чтобы считывать оптимальное напряжение 6 миллиньютонов. Отдохните ткань еще на 15-20 минут. Откройте программное обеспечение для сбора данных.
Измените номера отслеживания с 50 на 1, на 500 на 1 и нажмите кнопку Пуск. Перед началом нового эксперимента обязательно добавьте соответствующую метку в программное обеспечение для сбора данных. Процедите камеры еще раз, прежде чем добавлять в каждую камеру по 5 миллилитров раствора с высоким содержанием калия.
Снова осушите камеры, как только сократительная реакция на раствор с высоким содержанием калия достигнет плато для генерации силы. Промыть ткань раствором HEPES-PSS трижды. Добавьте в каждую камеру по 5 миллилитров высококалийного раствора.
Дренируйте камеры, как только сократительная реакция на высококалийный раствор достигнет плато для генерации силы и трижды промывайте ткань HEPES-PSS, затем отдохните ткань в течение 15-20 минут. Предварительно сжимают сегменты аорты сосудосуживающим агентом ПЭ в субмаксимальной дозе. Позвольте Индуцированной ПЭ кривой сокращения достичь плато для развития напряжения.
Добавьте плато развития напряжения к ПЭ при 5 микролитрах увеличения доз ацетилхолина рабочим составом растворов в 3-минутные интервалы для установления конечных концентраций ацетилхолина от 50 пикомоляров до 10 микромоляров в камере миографа, как описано в текстовой рукописи. После завершения эксперимента по дозовому ответу дренируйте камеры, трижды промывайте сегменты аорты теплым и аэрированным раствором HEPES-PSS и трижды отдыхайте ткани в течение 30 минут. После отдыха сегментов аорты в течение 30 минут дренируйте камеры и добавляйте свежий, теплый раствор с высоким содержанием калия в каждую камеру, затем дренируйте камеры и промывайте ткань раствором HEPES-PSS, когда реакция на сокращение на раствор с высоким содержанием калия достигнет плато F, как показано ранее.
Предварительно инкубируют сегменты аорты l-NAME путем добавления 10 микролитров приготовленного 100-миллимолярного рабочего раствора для оценки вклада продукции оксида азота в наблюдаемую ацетилхолин-индуцированную вазорелаксацию. Не удаляя название L, добавьте субмаксимальную дозу ПЭ в камеру, чтобы вызвать сокращение аорты. Подождите, пока Индуцированная ПЭ кривая сокращения достигнет плато для развития напряжения, затем добавьте ацетилхолин в камеру миографа, чтобы достичь конечной концентрации 500 наномоляров.
Подождите несколько минут, чтобы зарегистрировать любые возможные изменения в развитии силы, пока сформированное плато не станет стабильным. Процедите камеры и трижды промойте ткань теплым газированным раствором HEPES-PSS. Поместите камеру миографа под микроскоп и аккуратно пропустите небольшую проволоку через просвет аорты.
Осторожно перемещайте проволоку через просвет в течение короткого периода. Разрежьте аорту на 2-миллиметровые кольца аорты и установите эти кольца на камеру миографа. Установите оптимальное натяжение в 6 миллиньютонов и дайте ткани отдохнуть в течение 30 минут в аэрированном теплом буфере HEPES-PSS, затем слейте камеры и добавьте 5 миллилитров свежего теплого газированного раствора HEPES-PSS в каждую камеру.
Обнулите усилие для всех камер миографа и медленно поворачивайте микрометр против часовой стрелки, чтобы увеличить расстояние между штифтами, пока зарегистрированная сила не достигнет желаемого оптимального напряжения для аорты мыши. Надавите на ткань еще на 15-20 минут при оптимальном растяжении, затем снова процедите камеры, прежде чем добавлять 5 миллилитров высококалийного раствора в каждую камеру. Снова слейте камеры и трижды промойте ткань раствором HEPES-PSS, как только реакция сокращения на раствор ионов с высоким содержанием калия достигнет плато.
Отдохните ткань в течение 15-20 минут, затем предварительно сократите сегменты аорты с помощью ПЭ, сосудосуживающего агента. Когда сила, индуцированная ПЭ, достигнет плато, добавьте субмаксимальную концентрацию ацетилхолина в камеру миографа, чтобы достичь конечной концентрации 500 наномоляров. Подождите 3 минуты, чтобы убедиться, что зарегистрированное плато для развития силы, вызванной PE, не изменится, прежде чем закончить эксперимент.
Целостность и жизнеспособность каждого изолированного сосуда оценивали путем регистрации генерации силы сжатия. Пик зарегистрированной силы позже был использован для нормализации генерации силы для того же сегмента в ответ на агонисты. Измерения эндотелий-опосредованной вазорелаксации изображали опосредованное гладкой мускулатурой сокращение и генерацию силы.
Когда Индуцированное ПЭ сокращение достигло плато, увеличивая дозы ацетилхолина, достигали максимального вазорелаксирования в изолированном сегменте. Ингибитор оксида азота L-NAME полностью блокировал ацетилхолин-индуцированную вазорелаксацию в предварительно сжатой аорте, что указывает на то, что ацетилхолин индуцирует вазорелаксацию аорты за счет увеличения производства оксида азота. Кроме того, удаление эндотелиального слоя из сегментов аорты также блокировало ацетилхолин-индуцированную вазорелаксацию, подчеркивая роль эндотелия в расслаблении кровеносных сосудов.
Убедитесь, что вы нежны при обращении, очистке и рассечении кровеносного сосуда. Крайне важно добавить фармакологические агонисты и ингибиторы с осторожностью, чтобы не нарушить кольца кровеносных сосудов, установленные на камерах миографа. Информация может помочь в разработке экспериментов для изучения потенциальных терапевтических подходов к решению дисфункции слоев конкретного кровеносного сосуда.
